Abstract
Magekreft er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Identifisering av nye kreft biomarkører er nødvendig for å redusere dødelighetsratene gjennom utviklingen av nye screeningsanalyser og tidlig diagnostikk, så vel som nye mål-terapier. I denne studien utførte vi en proteomikk analyse av noncardia mage neoplasier av enkeltpersoner fra Nord-Brasil. Proteinene ble analysert ved to-dimensjonal elektroforese og massespektrometri. For identifikasjon av differensielt uttrykte proteiner, anvendte vi statistiske tester med bootstrapping resampling å få tak i type I-feil i den multiple sammenligningsanalysene. Vi identifiserte 111 proteiner involvert i magekreftutvikling. Det matematisk analyse avdekket flere proteiner som er involvert i energiproduksjonsprosesser og forsterket Warburg effekten i magekreft. ENO1 og HSPB1 uttrykk ble evaluert videre. ENO1 ble valgt på grunn av sin rolle i aerob glykolyse som kan bidra til Warburg virkning. Selv om vi har observert to opp-regulert flekker av ENO1 i proteomikk analyse ble den gjennomsnittlige ekspresjonen av ENO1 redusert i mage tumorer ved Western blot. Imidlertid synes bety ENO1 uttrykk for å øke i mer invasive svulster. Denne mangelen på korrelasjon mellom proteomikk og western blot analyser kan skyldes tilstedeværelsen av andre ENO1 flekker som presenterer en noe redusert uttrykk, men med en stor innvirkning på den midlere proteinekspresjon. I neoplasier er HSPB1 indusert av cellulært stress å beskytte cellene mot apoptose. I denne studien, HSPB1 presenteres en forhøyet protein og mRNA uttrykk i en undergruppe av magekreft prøver. Imidlertid ble det observert noen sammenheng mellom HSPB1 uttrykk og clinicopathological egenskaper. Her identifiserte vi flere mulige biomarkører for magekreft hos personer fra Nord-Brasil. Disse biomarkører kan være nyttig for vurdering av prognose og stratifisering for terapi hvis validert i større kliniske studier sett
Citation. Leal MF, Chung J, Calcagno DQ, Assumpção PP, Demachki S, da Silva IDCG, et al. (2012) Differential proteomikk Analyse av Noncardia Gastric Cancer fra enkeltpersoner i Nord-Brasil. PLoS ONE syv (7): e42255. doi: 10,1371 /journal.pone.0042255
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 9 februar 2012; Godkjent: 03.07.2012; Publisert: 30.07.2012
Copyright: © Leal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Dr. Chammas, Dr. Smith og Dr. Burbano) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Dr. Leal, Dr. Chung og Dr. Calcagno ) som tilskudd og måltids utmerkelser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Den samlede relative fem års overlevelse er i dag mindre enn 20% [2]. I Nord-Brasil, er GC den nest hyppigste neoplasi blant menn og den tredje i kvinner [3]. I Pará State, Nord-Brasil, er 5-års overlevelse ca 9-10% [4].
De to viktigste kreft stedene i GC er Cardia (proksimale) og noncardia (distale). Cardia GC påvirker fem ganger flere menn enn kvinner [5]. I tillegg forekomst av Cardia GC er relativt høy i den profesjonelle klassene [6]. I kontrast, har noncardia GC en mann-til-kvinne-forhold på ca 02:01 og forekomsten øker gradvis med alderen, med en topp forekomst mellom 50 og 70 år [7]. Risikofaktorer for noncardia GC inkluderer
Helicobacter pylori
infeksjon, lav sosioøkonomisk status, røyking, inntak av salt og røkt mat, og lavt inntak av frukt og grønnsaker [8]. I løpet av de siste tiårene, har forekomsten av noncardia GC vesentlig redusert i utviklede regioner av verden. Men utgjør dette subtype fortsatt flertallet av GC tilfeller på verdensbasis og er fortsatt vanlig i mange geografiske regioner, inkludert Kina, Japan, Øst-Europa og Sentral /Sør-Amerika [8]. Forståelsen av GC biologi og identifisering av kreft biomarkører er nødvendig for å redusere dødeligheten ved kreft screenings i høyrisikogrupper, for å øke tidlig diagnose, og for å utvikle nye mål terapier.
GC, som andre neoplasier , antas å skyldes en kombinasjon av miljøfaktorer og akkumulering av gener og spesifikke genetiske og epigenetiske forandringer, som påvirker onkogener, tumorsuppressorgener, og kontrollere genomisk ustabilitet. Flere gener /proteiner er blitt foreslått som GC biomarkører. I flertrinns magekreftutvikling, endringer av onkogener MYC, KRAS2, CTNNB1, erbB2, FGFR2, CCNE1 og HGFR, samt av tumordempere TP53, APC, RB, DCC, RUNX3 og CDH1 har så langt rapportert (se anmeldelser [9], [10]). Selv om deregulering av disse genene /proteinene har blitt nøye studert i GC, er en mer komplett profilering nødvendig for å forstå kreftprosessen.
Det siste tiåret i biovitenskap ble sterkt påvirket av utviklingen av «omics» teknologier (genomikk, transcriptomics, proteomikk og metabolomics) som tar sikte på å skildre et globalt perspektiv på biologiske systemer og forståelsen av den levende cellen [11]. Siden proteiner er til syvende og sist ansvarlig for ondartet fenotype, kan proteomikk analyser gjenspeile den funksjonelle tilstand av kreftceller, og derfor har forskjellige fordeler fremfor genomikk og transcriptomics studier [12]. Videre proteiner er i dag den viktigste målet molekyler av kreft narkotika [13].
Noen proteomikk-baserte studier ble tidligere utført i humane primære mage tumorer (se anmeldelse [14]). Men de fleste av disse studiene analyserte svulster personer fra asiatiske befolkningen, og dermed viser ikke nødvendigvis den distinkte biologiske og kliniske atferd blant GC prosesser. GC er preget av globale variasjoner i forekomst, etiologi, naturlige forløp, og ledelse [15]. Selv om 90% av mage svulster er adenokarsinomer [7], flere faktorer føre til biologisk og klinisk GC undergrupper: antecedent tumorigene forhold, for eksempel
Helicobacter pylori
gastritt og andre kroniske mage patologi; plassering av den primære tumor (cardia og noncardia region); subtyper av adenokarsinom (diffuse, intestinal, eller blandet [16]); etnisitet den elendige befolkningen (forskjellige nivåer av følsomhet og aggressivitet av svulstene); og en prediktiv biomarkør (ErbB2) [15]. Således er uttrykket «gastrisk cancer» brukes for å beskrive flere neoplasier som påvirker mageregionen.
I den foreliggende undersøkelse har vi sammenlignet ekspresjonsprofilen av noncardia GC og den samsvarende ikke-neoplastisk gastrisk vev fra individer fra Northern Brasil (alle med
H. pylori
infeksjon), og identifisert et protein signatur som ble uttrykt forskjellig mellom de to gruppene av en to-dimensjonal elektroforese (2-dE) -metoden. Å screene proteiner knyttet til utviklingen av magekreftutvikling, vi også sammenlignet ikke-neoplastiske mage vev med GC prøver av personer med og uten lymfeknutemetastaser. For valg av ulikt uttrykte proteiner, brukte vi en statistisk parametrics test med bootstrapping resampling. Vi har foretatt en omfattende beregnings analyse av vev proteomikk data å oppdage stier og nettverk involvert i mage onkogenese og progresjon. De mulige assosiasjoner blant enolase 1 (ENO1) og heat shock 27 kDa protein 1 (HSPB1) gen og protein uttrykk, og clinicopathological egenskaper ble også evaluert hos personer fra Nord-Brasil. Disse to proteinene er rapportert ofte som deregulerte molekyler i forrige GC proteomikk studier i andre populasjoner. Men de ble aldri vurdert i en brasilianske befolkningen.
Metoder
kliniske prøver
For protein profilering analyse, noncardia GC prøver og tilsvarende ikke-neoplastisk gastrisk vev (fjernt sted av primærtumor; kontrollgruppe) ble samlet fra 15 pasienter. Ytterligere parede prøver ble tatt med for western blot og sanntids kvantitativ PCR (RT-qPCR) analyser. Dissekert vevsprøver ble hurtigfrosset i flytende nitrogen etter kirurgisk disseksjon og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Alle mage prøvene ble oppnådd kirurgisk fra João de Barros Barreto universitetssykehus (HUJBB) i Pará State, Nord-Brasil. I Pará stat, er den menneskelige befolkning består av inter krysninger mellom tre hoved opprinnelse grupper: Europeisk (hovedsakelig representert av portugiserne), afrikanere og indianere [17]. Alle pasientene hadde negative historier av eksponering for enten kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen, og det var ingen andre co-forekomst av diagnostisert kreft. Skriftlig informert samtykke med godkjenning av etikkutvalg av HUJBB ble innhentet fra alle pasienter før prøvetaking.
Alle prøver ble klassifisert i henhold til Laurén [16] og svulster ble iscenesatt ved hjelp av standard kriterier TNM staging [18] . Tilstedeværelsen av
H. pylori
, en klasse I karsinogen, i gastriske prøver ble detektert ved PCR-analyse for urease-genet [19] og dets for virulens faktor vacuolating cytotoksin (CagA) [20] ved å bruke DNA renses samtidig med proteiner og mRNA. I hvert PCR forsøk ble positive og negative kontroller inkludert.
For å redusere prøve heterogenitet, 2-DE analysen inkluderte bare noncardia GC og mageprøver presentere
H. pylori
infeksjon CagA +, som synes å være vanlig i vår befolkning (upubliserte data). Tabell 1 viser clinicopathological karakteristikk av prøvene brukes for protein profilering analyse.
Protein, mRNA og DNA rensing
Totalt protein, mRNA og DNA ble samtidig isolert fra mage vevsprøver hjelp den AllPrep DNA /RNA /Protein Kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinet pellet ble oppløst i buffer inneholdende 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% protease inhibitor cocktail (Sigma), og 0,5% av hver fosfatase inhibitor cocktail 1 og 2 (Sigma-Aldrich, USA ). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved metoden til Bradford (Sigma-Aldrich, USA). RNA konsentrasjon og kvalitet ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland) og 1% agarosegel. Prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil bruk.
2-DE proteomforskning profilerings
Proteiner ble separert ved to-DE [21]. Proteinprøver (300 mikrogram) ble lastet på IPG strimler (pH 3-10 L, 18 cm, GE Healthcare, USA). Strimlene ble rehydratisert i 12 timer ved 50 V. isoelektrisk fokusering ble utført ved bruk av følgende program: 200 V i 2 timer, 300 V 30 min, 500 V 30 min, 1 000 V en time, 8000 V i 1,5 timer og 80 000 Vh. Den fokuserte Strimlene ble redusert med 50 mM DTT og alkylert med 100 mM jodacetamid i buffer inneholdende 6 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, og spor bromfenolblått. For sekundær elektroforese ble de behandlede strimler som er lagt på toppen av 12,5% SDS-PAGE (200 mm) sammen med de PeppermintStick ™ fosfoprotein Molekylvektstandarder (Invitrogen, USA). I alle forsøkene ble GC og sammenkoblede kontrollprøver utføres samtidig. Alle 2-DE geler ble utført i duplikat.
Proteinene på de to-DE geler ble visualisert ved hjelp SYPRO® Ruby Gel Stain (Invitrogen, USA) etter produsentens anbefalinger. Bilder av gels farget med SYPRO® Ruby ble skannet med en 582 nm eksitasjon og 610 nm 30 båndpass utslipp filter på en Typhoon Trio imager (GE Healthcare, USA). For flekk fjerning og påfølgende massespektrometri analyse ble gelene visualisert med Coomassie Brilliant Blue G250 farging.
Bildeanalyse og sted identifikasjon
Gel bildene ble analysert med PDQuest Avansert programvare versjon 8.0 (Bio -Rad, USA), i henhold til produsentens protokoll. Automatisk deteksjon sted i hver gel ble bekreftet ved visuell inspeksjon. Noen flekker ble brukt som landemerker for å justere bildene. Spot intensiteter ble normalisert for å utjevne den totale tettheten av hver gel bilde ved hjelp av den lokale regresjonsmodellen. Normaliserte protein spotvolum i proteom ble sammenlignet mellom eksperimentelle grupper
Vi har laget to sett med analyser for å identifisere forskjellig uttrykt spots:. (1) sammenligning av protein uttrykk mellom svulsten og matchet kontrollgruppe bruker paret t-test; (2) sammenligning av proteinekspresjon blant kontrollprøvene, GC uten lymfeknute-metastaser, og GC med lymfeknute-metastaser ved bruk av én-veis analyse av varians for uavhengige prøver (en-veis ANOVA). I tillegg ble det post-hoc sammenligninger utført med Tukey test for variabler normalfordelte og med Games-Howell for distribusjoner der like avvik ikke kan antas. De parametriske tester Analysene ble utført med bootstrapping, en resampling metode. Den bootstrapping metoden [22] gir en kritisk justert p-verdi, kontrollere en type I feil (falsk positiv), redusere over-fit partiskhet og validere nøyaktigheten estimater. Den bootstrapping teknikk kan gi en mer nøyaktig og mindre konservative familywise feilrate (FWER) enn standardmetoder (f.eks Bonferroni tilpasning) for multicomparison analyser [23]. Vi utførte alle analysene for å identifisere ulikt uttrykte proteiner basert på 1000 bootstrap prøver. I alle analysene, konfidensintervall (CI) var 95% og p-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
For protein identifikasjon av massespektrometri, vi filtrert ut betydelige flekker presentere en fold endring under 1,5 ganger i tettheten mellom to forsøksgrupper. Disse flekker ble observert i løpet av mindre enn 30% av prøvene i en gruppe [24].
Massespektrometri analyse
Flekkene av interesse ble kuttet ut for etterfølgende massespektrometri-analyse [25] manuelt. I tillegg ble tomme gel stykker fra en spot-free-regionen, og referanse flekker (kjent markørproteiner fra 2-DE) Bolts, fungerte som kontroller for trypsin fordøyelsen, og ble kjørt parallelt med protein flekker av interesse. Etter avfarging og vasking ble gelpartiklene underkastet in-gel fordøyelse med 20 ng /mL av Trypsin gull (massespektrometri Grade, Promega Corporation, USA) i 25 mM ammoniumbikarbonat ved 37 ° C over natten. Fordøyd peptider ble gjenvunnet, plassert i en hurtig vac sentrifuge til den er tørr, og ble rekonstituert i 15 ul 0,1% maursyre i vann. Peptidet Blandingen ble analysert ved hjelp av C18 ultra-væskekromatografi (UPLC, NanoAcquity, Waters, USA) sammen med ESI-TOF kvadrupol massespektrometer (ESI-QTOF Ultima, Waters /Micromass, USA). Gradienten var 0-80% acetonitril i 0,1% maursyre i løpet av 20 eller 10 min. Alle MS /MS spektra ble søkt mot IPIhuman 379 databasen ved hjelp MASCOT søkemotor (Matrix Science), akseptere en savnet tryptisk spalting og carbamidomethyl (C) som fast modifikasjon og oksidasjon (M) som variabel modifikasjoner. Peptide toleranse var ± 0,1 Da og MS /MS-Toleranse var ± 0,1 Da. Høyeste tillit identifikasjon hadde signifikant søkeresultater og protein identifikasjoner var basert på minimum 2 peptid treff.
Bioinformatikk analyse
De identifiserte proteiner (fra bare de stedene hvor en protein ble identifisert) var klassifisert i grupper etter subcellulære compartmentalization, biologisk prosess, og molekylære funksjon basert på informasjonen kommenterte i Gene ontologi (GO) Consortium databaser (https://www.geneontology.org/). Denne klassifiseringen analyse ble utført ved hjelp av DAVID funksjonelle merknad verktøyet (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [26]. Den kromosom plassering av identifiserte proteiner ble åpnet ved hjelp BioMart data mining verktøy direkte fra Ensembl database (https://www.ensembl.org/biomart/martview).
PANTHER-systemet (www.pantherdb.org/) , MetaCore programvare (GeneGo Inc.), og oppfinnsomhet Pathways Analyse 9.0 (IPA, oppfinnsomhet Systems Inc.) ble brukt til vei, nettverk og funksjonelle analyser av ulikt uttrykte proteiner. Alle rapporterte trasé og biologiske prosesser er oppført i henhold til deres GO berikelse poengsum levert av programvarepakker som -log (p-verdier) og med en falsk Discovery Rate (FDR) på 0,05%.
uten tilsyn clustering analyse ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjon av de normaliserte (z-score) verdier av alle vesentlige ulikt uttrykte proteiner (unik ID med spot) av 30 prøver i analysen sett. Varme kartene ble generert ved hjelp av Heatmap byggherre (https://ashleylab.stanford.edu/tools_scripts.html) å arrangere protein uttrykk profiler og prøver på grunnlag av deres likhet. Hver farget celle på den to-dimensjonale kart representerer proteinekspresjon verdi av prøven. Stadig positive verdier er angitt med røde med økende intensitet, og stadig mer negative verdier av greener med økende intensitet. Dendrogrammer på toppen av kartet varmen viser gruppering av prøvene og på siden av den gruppering av protein uttrykk.
ENO1 og HSPB1 uttrykk
protein og mRNA brukes for ENO1 og HSPB1 uttrykket-analyser ble renset samtidig med proteinprøven som brukes for 2-dE-geler.
for western blot-analyse, reduserte protein (20 ug for ENO1 og 30 ug for HSBP1) av hver prøve ble separert på 12,5% SDS homogene siders gel og elektro-blottet på en PVDF membran (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF-membranen ble blokkert med fosfat-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20, 5% fettfattig melk og inkubert over natten ved 4 ° C med tilsvarende primære antistoffer til anti-ENO1 (sc-100812, 1:3000, Santa Cruz Biotechnology, USA ), anti-HSBP1 (sc-13132, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), og anti-ACTB (Ac-74, 1:3000, Sigma-Aldrich, USA). Etter omfattende vasking ble et peroksidase-konjugert sekundært antistoff ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Immunoreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av Western blotting Luminol-reagens, og bildene ble ervervet ved å bruke en Imagequant 350 digital bildesystem (GE Healthcare, Sverige). ACTB ble brukt som en laste referanse kontroll.
For RT-qPCR analyse, ble det komplementære DNA syntetisert ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems, Polen) i henhold til produsentens protokoll. Alle real-time RT-qPCR analysene ble utført i tre eksemplarer for både target genet (
ENO1
: Hs00361415_m1;
HSPB1
: Hs03044127_g1, Applied Biosystems, USA) og internkontroll (
ACTB product:: Hs03023943_g1;
GAPDH
: Hs99999905_m1, Applied Biosystems, USA) ved hjelp av primere og TaqMan prober. Relativ kvantifisering (RQ) av genekspresjon ble beregnet i henhold til Pfaffl metode [27]. En kontrollprøve ble utpekt som en kalibrator for hver sammenkoblet svulst.
Statistisk analyse av ENO1 og HSBP1 uttrykk data
Vi har evaluert først den normale fordelingen av alle data ved hjelp av Shapiro-Wilk normalitet test for å bestemme påfølgende bruk av hensiktsmessige tester for statistisk sammenligning.
ENO1
mRNA nivåer og HSPB1 uttrykk data ble ikke normalfordelte og ble forvandlet (z-score) for analyse. Paret t-test ble utført for å sammenligne middelverdien av ENO1 og HSPB1 proteinekspresjon mellom kontroll- og GC prøver. Assosiasjonene mellom clinicopathological parametere og gjennomsnittet av ENO1 og HSPB1 uttrykk ble vurdert ved hjelp av T-test for uavhengige utvalg. Chi-kvadrat-test (χ
2) ble også brukt til å evaluere forholdet mellom ekspresjonsdata og clinicopathological faktorer. Korrelasjonen mellom ENO1 og HSPB1 mRNA og protein ekspresjon (western blot og 2-DE-analyser) ble analysert ved hjelp av Spearman-test. I alle analysene, CI var 95% og p-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Diskusjon
proteomikk analyser av magevevet
Vi analyserte proteomet av
Resultater og 15 noncardia GC prøver – 6 uten lymfeknutemetastase og 9 med lymfeknutemetastase – og 15 passet kontroll vev (tabell 1). Ved hjelp av to-DE med pI utvalg av 3,0 til 10 og molekylær varierer mellom 10 kDa og 120 kDa, ble ca 1000 plasser tydelig oppdaget av gel og senere analysert for differensial protein uttrykk. Figur 1 viser representative gel bilder med flekker og deres protein ID. Noen proteiner ble reflektert av flere spots mest sannsynlig på grunn av posttranslational endring som fører til skift i 2-DE gel. Detaljer om protein identifikasjoner, teoretiske pI verdi, molekylvekt, protein score, sekvens dekning, antall matchet peptider, samt gjennomsnittlig relativ endring og p-verdier er vist i supplerende tabeller S1 og S2. Disse tabellene viser også hvilke proteiner ble tidligere observert i GC proteomikk studier.
Proteiner ble løst over pI området 3-10, fulgt av 12,5% SDS-PAGE og farget med SYPRO® Ruby. De identifiserte proteiner som viste signifikant endret uttrykk i mage karsinogenese er merket med respektive protein-IDer.
Selv om noen proteomikk-baserte studier ble tidligere utført i humane primære mage svulster, så vidt vi vet, bare tre studier fokusere på noncardia GC [28], [29], [30]. Mest GC proteomic studier identifiserte differensielt uttrykte proteiner basert bare på en fold endring mellom to betingelser [24], [28], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Andre tidligere GC proteomic studier utført statistiske analyser for å sammenligne den proteinekspresjon mellom gruppene [29], [36], [37], [38], [39], men uten regulering av type I (falsk positiv) feil. Det er interessant å merke seg at vi sammenlignet protein profilering av svulster og ikke-neoplastiske prøver ved hjelp av parametriske tester med bootstrapping for forskjellig uttrykt protein identifikasjon. De resampling metoder, som vanligvis brukes i microarray studier [40], har blitt brukt til å lage p-verdi justeringer for flere testprosedyrer som styrer FWER og ta hensyn til avhengighet strukturen mellom testobservatorene [41]. Målet er å skape mange sett med bootstrap prøver ved resampling med erstatninger fra de opprinnelige dataene [22].
Sammenligningen av tumor og kontrollprøver av paret T-test og bruk av bootstrapping avdekket 133 flekker som ble signifikant endret med mer enn 1,5 ganger endring. Etter en Mascot database søk ved hjelp av de innsamlede MS-data, ble 97% av stedene identifisert. Blant disse flekker, ble 18% identifisert med mer enn ett protein. Analysene av flekkene med en unik identifiserte proteiner viste at 33 flekker av 26 proteiner var oppregulert og 72 av 56 proteinene ble nedregulert i GC prøvene sammenlignet med ikke-neoplastisk vev.
Sammenligningen av svulst og kontrollprøver ved en-veis ANOVA viste 143 differensielt regulerte flekker og 98% av disse ble identifisert. Det ble observert at 94 flekker var vanlig i paret t-test og ANOVA analyser. Når det gjelder de flekker med en unik identifisert protein, observerte vi at 54 proteiner ble nedregulert og 9 ble oppregulert i tumor uten lymfeknutemetastase i forhold til kontrollprøver. Vi har også observert at 68 proteinene ble nedregulert og 15 ble oppregulert i tumorer med lymfeknutemetastaser sammenlignet med kontrollprøver. Vi oppdaget 38 proteiner forskjellig uttrykt mellom ikke-neoplastiske prøver og svulster uavhengig av lymfeknute status.
Fjorten proteiner som presenteres signifikante endringer mellom svulster med og uten lymfeknutemetastase (figur S1). Uttrykket av NNMT stadig økt mens ATP5H og UQCRFS1 viste en kontinuerlig reduksjon fra ikke-neoplasi å tumorigenesis med lymfeknutemetastase. NNMT ble tidligere rapportert med forhøyet ekspresjon i GC sammenlignet med ikke-neoplastiske prøvene [24], [42]. Den reduserte uttrykk for ATP5H og UQCRFS1 kan skyldes en lavere avhengighet av oksidativ fosforylering for energiproduksjon, på grunn av Warburg effekten i avansert tilstand (se bioinformatikk resultatene nedenfor).
Funksjonell klassifisering av ulikt uttrykte proteiner i GC
GeneGo biomarkør analyse viste at de fleste av de identifiserte proteiner forutsagte markører for gastrointestinale sykdommer, inkludert GC (figur 2A, er representative for tumor mot nontumor sammenligning). Dette støtter gjeldende data og indikerer at funnene bør undersøkes nærmere for å identifisere eller validere klinisk relevante mål for diagnose og /eller prognose av GC.
A) Anriking av GeneGo sykdom ved hjelp av forskjellig regulert proteiner mellom neoplastiske og matchet ikke-neoplastiske prøver; B) Cellular avdelinger, C) Biologiske prosesser, D) Molekylære funksjoner og E) kromosom plassering av alle identifiserte proteiner.
De identifiserte proteinene ble gruppert i ulike klasser basert på funksjonell informasjon tilgjengelig. De fleste av de identifiserte proteiner var intracellulære organelle proteiner og var en del av de membranbundne organeller, spesielt mitokondriene (figur 2B). Disse proteinene er involvert i hovedsak i cellulære metabolske prosesser og oksidasjon-reduksjon (figur 2C). Sammenligningen av tumorer med lymfeknutemetastaser og kontrollprøver viste transport- og etablering av plasseringen som anriket biologiske prosesser. Dette ble ikke observert i sammenligningen av tumorer uten lymfeknutemetastaser og kontrollprøver. Oksidoreduktasen aktivitet etterfulgt av koenzym-bindende aktivitet var de viktigste molekylære funksjoner av de som er involvert i gastrisk karsinogenese (figur 2D) proteiner.
Når det gjelder den kromosomale beliggenhet, de fleste av proteinene ble kodet for av gener som befinner seg på kromosom 1 (11 %), kromosom 19 (8%), og kromosom 11 (7%) (figur 2E). Komplekse Karyotyper av mage svulster fortrinnsvis involvere disse kromosomer, samt kromosomer 3, 6, 7, 8, 13 og 17 (se anmeldelse [9]). Gevinst og tap av kromosom regioner på 1, 19 og 11 ble tidligere rapportert av vår forskningsgruppe i GC prøver [43], [44]. Dermed kan disse kromosomene inneholde flere loci med dosesensitive gener.
Nettverk analyse av ulikt uttrykte proteiner i GC
Vi har foretatt en omfattende beregnings analyse av vev proteomikk data å oppdage trasé og nettverk involvert i mage onkogenese og progresjon. Tabell 2 viser de viktigste kanoniske trasé ved å bruke databasen Ingenuity Pathway Analysis (IPA). De viktigste kanoniske baner i magekreftutvikling prosessen var involvert i energiomsetningen trasé inkludert mitokondriell dysfunksjon, pyruvat metabolisme, oksidativ fosforylering, citrate sirkel, og glykolyse /glukoneogenesen. Denne studien viste et stort antall differensial uttrykt metabolske proteiner som ikke er blitt rapportert tidligere i noncardia magekreftutvikling (tabell S1 og S2).
Vår proteomikk analyse avdekket at flere enzymer i citrate syklus ( Krebs syklus) og oksidativ fosforylering ble nedregulert i GC-celler. Disse dataene viser mulige endringer i mitokondrie-funksjonen og et skifte i energiproduksjon i dagens GC-celler, noe som tyder på Warburg effekten [45]. Prolifererende tumorceller omprogrammere deres metabolske veier for å generere energi, og således understøtte den raske celledeling under stress metabolske betingelser som er karakteristiske for den unormale tumor mikromiljøet [46]. Selv under normale oksygenkonsentrasjoner, tumorceller skifte fra ATP generasjon gjennom oksidativ fosforylering til ATP generasjon gjennom glykolyse, konvertere mest innkommende glukose til laktat [45]. Det er blitt foreslått at høyaktiv glykolyse gir et biosyntetisk fordel for tumorceller. Glykolyse gir nok metabolske mellomprodukter ved å unngå oksydasjon av glukose, som er avgjørende for syntese av makromolekyler, slik som lipider, proteiner og nukleinsyrer, i løpet av celledeling [47], [48], [49].
laktat dehydrogenase (LDH) og pyruvat dehydrogenase (PDH) komplekser kontrollere metabolismen av pyrodruesyre, trans til enten melkesyre eller acetyl-CoA deretter skrive inn citrate syklus. Nedregulering av subenheter av LDH og PDH-komplekser antyder en reduksjon i pyruvat fluks inn i citrat syklus og en reduksjon i frekvensen av oksidativ fosforylering og oksygenforbruk, og forsterker den glykolytiske fenotype. Andre nedregulert proteiner, slik som LIPF og GOT1, markere aktivering av andre metabolske veier med nedskrivning av citrate syklus og oksidativ fosforylering. Flere metabolske endringer som vi observerte i noncardia GC ble også beskrevet av Cai
et al.
[36] i en Cardia GC proteomikk studier, som tyder på at disse metabolske forandringer er ikke spesifikke for en GC subtype basert på tumor plassering.
av PANTHER- system, er det vesentlig anriket metode ble p53 pathway observert i sammenligningen mellom tumor og kontrollprøver. I tillegg til sin funksjon i DNA-skade respons og apoptose, er p53 også en regulator av cellemetabolismen [50]. p53 fremmer oksidativ fosforylering [51] og hemmer også glykolysen med opp-regulerer ekspresjonen av TP53-indusert glykolyse og apoptose regulator (tigar) [52]. Derfor, tap av p53 bidrar til anskaffelse av glycolytic fenotype. Tapet av
TP53
locus er et vanlig funn i GC av enkeltpersoner fra Nord-Brasil [53]. Videre er 20% av GC analysert ved to-DE presentert p53 immunoreaktivitet (data ikke vist). P53-immunreaktivitet vanligvis avhenger av akkumulering av muterte proteiner i cellen, noe som fører til en lengre halveringstid [54].
De øverste nettverk av molekylære interaksjoner og funksjoner ble også identifisert ved anvendelse av IPA-programvaren (fig S2 ; Tabell 3; Subnett- fra MetaCoreTM analyse ble ikke vist). Vi viste flere forskjellig regulerte proteiner involvert i celle montering og organisasjon, og i inflammatoriske prosesser. Den cellulære montering og organisasjon var den hovedsakelig anriket nettverket observeres i sammenligning mellom kontrollene og tumorer med lymfeknutemetastase.
