Abstract
Bakgrunn
Studien ble designet for å oppdage uttrykket nivået av thimet oligopeptidase (THOP1) protein i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og undersøke dens korrelasjon med clinicopathologic funksjoner og prognose.
Methods
Immunhistokjemisk farging ble anvendt for å bestemme ekspresjon av THOP1 protein i 120 NSCLC-prøver og 53 fjernt normalt lungevev. Kvantitativ real-time PCR og Western blotting ble benyttet for å måle uttrykket av THOP1 i 16 par primære NSCLC og tilsvarende normale vev.
Resultater
Analyse av immunhistokjemisk farging foreslo lav THOP1 uttrykk ble funnet i 71 (59,2%) av de 120 NSCLC prøvene og signifikant korrelert med positiv lymfeknutemetastase (
P
= 0,048). Imidlertid lav THOP1 ekspresjon ble funnet i 22 (41,5%) av de 53 normalt lungevev. Chi-kvadrat test foreslått at uttrykket av THOP1 var signifikant høyere i normal lunge vev enn i NSCLC prøver (
P
= 0,032). Real-Time PCR og Western blotting viste at NSCLC prøvene hadde gått ned THOP1 mRNA og protein uttrykk i forhold til tilsvarende normalt vev. Univariat analyse viste at lav THOP1 uttrykk betydelig spådd redusert 5-års sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,038) og total overlevelse (
P
= 0,017). I tillegg positiv lymfeknutemetastase (
P
= 0,025) og avansert TNM stadium (
P
= 0,009) betydelig spådd redusert 5-års overlevelse. Men multivariat Cox regresjonsanalyse viste at bare lav THOP1 uttrykk beholdt sin betydning som en selvstendig prognostisk faktor for ugunstig 5 års sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,046) og total overlevelse (
P
= 0,021).
Konklusjoner
THOP1 kan ha klinisk potensiale til å bli anvendt som et lovende biomarkør for å identifisere individer med bedre prognose og et nytt antitumormiddel for behandling av pasienter med NSCLC.
Citation: Qi L, Li Sh, Si Lb, Lu M, Tian H (2014) uttrykk for THOP1 og dens forhold til prognose i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE ni (9): e106665. doi: 10,1371 /journal.pone.0106665
Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: May 23, 2014; Godkjent: 30 juli 2014; Publisert: 02.09.2014
Copyright: © 2014 Qi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 30571844), Stiftelsen Science and Technology Development i Shandong-provinsen (No . 2009GG10002007), og Natural Science Foundation National Shandong-provinsen (No. ZR2009CM090). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en av de vanligste intratorakale malignitet over hele verden på grunn av den sene klinisk presentasjon og rask progresjon [1], [2]. Til tross for noen fremskritt i tidlig oppdagelse og radikal kirurgisk fjerning kombinert med adjuvant behandling i løpet av det siste tiåret, prognosen for NSCLC pasienter forbli relativt dårlig [3]. Det er generelt anerkjent at genetisk heterogenitet og miljømessige faktorer føre til tumorigenesis av lungekreft samtidig. Derfor er identifisering av nye prognostiske biomarkører med mulig terapeutisk og prognostisk betydning viktig å optimalisere behandlingen av NSCLC
Thimet oligopeptidase (THOP1; EC3.4.24.15 eller EP 24.15). Er en karakteristisk metallopeptidases med HEXXH sink bindingsmotiv og forbundet med metabolismen av flere nevropeptider inneholdende fra 5 til 17 aminosyrer, så som bradykinin, gonadotropin-frigivende hormon, neurotensin opioider og [4], [5], [6]. Akkumulerte bevis antydet at THOP1 er hovedsakelig uttrykt i cytosol, endoplasmatiske retikulum, mitokondrier og kjernen i forskjellige normale humane vev og tumorceller [7], [8], [9]. Videre immunhistokjemisk analyse indikerte at THOP1 var til stede i 90% av NSCLC-cellelinje H1299 og utskilt av cellene for å spalte og aktivere DTS-201 [10]. Nylig studie viste at høy THOP1 mRNA ekspresjon nivået i normal bakgrunns leveren av hepatocellulært karsinom (HCC) ble signifikant korrelert med bedre overlevelse [11]. Videre THOP1 kunne hemme tumor angiogenese og tumor proliferasjon fremmet av BK i melanomceller [12]. Disse funnene indikerer THOP1 kan være en potensiell anti-tumor middel for tumorterapi.
Uttrykk for THOP1 og dens rolle i prognosen av NSCLC er ikke så langt undersøkt. Derfor, vi har oppdaget uttrykk nivåer av THOP1 protein hos pasienter med NSCLC ved å bruke immunhistokjemisk metode for å undersøke dens korrelasjon med clinicopathologic funksjoner, postoperativ svulst tilbakefall og prognose.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Qilu Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient å publisere tilfelle detaljer, og oppkjøpet av vevsprøver ble utført som foreskrevet av de institusjonelle retningslinjer.
Pasienter
tumorprøver (n = 120, mener alder 61 ± 4,35 år) og fjerne normale lungevev (n = 53, 5 cm fra kanten av svulsten) ble samlet fra pasienter med NSCLC som gjennomgikk komplett tumorreseksjon (lobektomi eller pneumonectomy) med regional lymfeknute disseksjon mellom januar 2006 og desember 2007 ved avdeling for Thoracic Surgery, Qilu Hospital. Histologisk undersøkelse og grad av kreft celledifferensiering var basert på klassifiseringssystemet for Verdens helseorganisasjon revidert i 2004 og TNM staging system for UICC 2009. Ingen pasienter hadde gjennomgått ufullstendig reseksjon og fikk cellegift eller strålebehandling før operasjonen. De kliniske egenskapene til disse 120 pasientene er presentert i tabell 1.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging for THOP1 ble utført ved hjelp av streptavidin-peroksidase metoden. I korte trekk, ble 4-mikrometer tykke seksjoner skåret fra parafin-innleiret blokker, deparaffinized i xylen og dehydratisert gjennom en gradert serie av alkohol. Seksjonene ble inkubert i citrat-buffer (pH 6,0) med en mikrobølgeovn. Etter å være avkjølt til romtemperatur, ble platene inkubert i 3% hydrogenperoksid i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet og inkubert med et muse-monoklonalt antistoff mot THOP1 (Abcam, Cambridge, MA, USA, fortynning 1:50) over natten ved 4 ° C. Deretter ble den biotinylerte sekundære antistoff og peroksidase-konjugert streptavidin kompleks reagens påført, etterfulgt av kontra med Mayers hematoksylin. Positive og negative kontroller ble inkludert i hvert trinn.
Evaluering av THOP1 Protein Expression
De immun lysbilder ble evaluert av to uavhengige etterforskere i en blindet mote og revurderes ved disse etterforskerne under et multihode mikroskop uharmoniske tilfeller å komme til en enighet. Ekspresjon av THOP1 protein ble vurdert ved å beregne en total poengsum immunofarging som produktet av både stillingen intensitet (0, negativ farging, 1, svak farging, 2, moderat farging, 3, sterk farging) og andel score (0, 0- 5%, 1, 6-25%, 2, 26-50%, 3, 51-75%, 4, ≥76%), henholdsvis. Dermed blir total score varierte fra 0 til 7. Verdien cutoff for høy og lav THOP1 ble bestemt på grunnlag av en heterogenitet verdi måles gjennom en log-rank statistisk analyse med hensyn på total overlevelse. Den persentilen som ga minimum
P
verdien ble valgt som cut-off punkt [13]. I korte trekk ble 120 pasienter ordnet i rekkefølge av det totale fargings poengsum påvist ved immunohistokjemisk analyse fra store til små. Ved hver persentil fra 10 til 90, ble dataene delt i to grupper og forskjeller i total overlevelse ble analysert ved hjelp av log-rank test. Den 41. persentilen tilsvarer den totale farging score på fire ga minimum
P
verdi (
P
= 0,017) og ble valgt som cutoff punktet. Derfor var den totale farving stillingen av 4 valgt som cutoff punkt for diskriminering mellom høy og lav THOP1 uttrykk. Svulster med en total flekker poengsum ≥4 ble alle definert som høy THOP1 uttrykk, og svulster med en total flekker poengsum. fire ble alle definert som lav THOP1 uttrykk
RNA Utvinning, omvendt transkripsjon Polymerase Chain Reaction og kvantitativ real-Time PCR
Totalt RNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp av Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komplementær DNA (cDNA) ble syntetisert av Super III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad, CA, USA) for THOP1 i henhold til produsentens instruksjoner. Nivåene av THOP1 messenger RNA (mRNA) ble normalisert til den menneskelige β-aktin uttrykk nivå og beregnes på grunnlag av 2
(- △△ CT) -metoden. Primere ble brukt som følgende: forstand: De primere for β-aktin var: 5′-GCATCCACGAAACTACCT-3 «(fremover) og 5′-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3′ (bakover). THOP1 primere var: 5»-CAT GGC CAA GAC CAG CCA GA-3 «(fremover) og 5′-CGC ACG CTT CAG CTC CAG AA-3» (bakover)
SDS-PAGE og Western Blot.
Proteiner ble hentet ved hjelp av RIPA lysebuffer. Like mengder (20 pg) protein ble underkastet SDS-PAGE-analyse, overført på nitrocellulosemembraner og probet med primære antistoffer. Antistoff mot THOP1 ble kjøpt fra Abcam (Abcam, Cambridge, MA, USA, fortynning 1:1000). Anti-β-actin antistoff ble levert fra Sigma (Sigma, St. Louis, USA). Proteinbåndene ble påvist ved hjelp av den forbedrede chemiluminescence metoden (Millipore, Billerica, MA, USA). Den optiske band tetthet ble kvantifisert (Imager av Alpha Corporation, San Leandro).
Følg opp
Alle pasienter utskrevet fra sykehus ble fulgt opp på poliklinikken hver 3 til 6 måneder. Oppfølging evaluering av pasientene bestod av fysisk undersøkelse, blodprøver, computertomografi, ultralydundersøkelse, brystet X-ray, og fiberoptiske bronchoscopy om nødvendig. Plasseringen og tid for tumor tilbakefall ble registrert. Oppfølging ble gjennomført i alle pasienter før desember 2013, og median oppfølgingsperiode var 48 måneder (variasjon: 15~96 måneder).
Statistical Analysis
Statistisk analyse av data var utføres av SPSS 17.0 system. Chi-kvadrat test ble utført for å undersøke sammenslutningen av THOP1 og ulike clinicopathologic faktorer. Oppfølging tid ble sensurert dersom pasienten ble tapt for oppfølging. Overlevelseskurver ble trukket ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med den log-rank test. Multivariat Cox regresjonsanalyse ble brukt for å identifisere vesentlige uavhengige prognostiske faktorer. Alle data er gjennomsnitt ± standard avvik (SD) fra uavhengige analyser. Andre statistiske analyser ble utført ved anvendelse av en t-test.
P
0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
1.. Uttrykk av THOP1 i NSCLC og dens korrelasjon med clinicopathologic faktorer
Vi oppdaget uttrykk for THOP1 protein i 120 NSCLC prøvene og 53 normale lunge vev ved hjelp av immunhistokjemi. Som vist på fig. 1, immunhistokjemi med THOP1 antistoffer viste en positiv reaksjon i cytoplasma av NSCLC celler. Ifølge våre tidligere definerte kriterier, ble høy THOP1 ekspresjon funnet i 49 (40,8%) av de 120 vevsprøver og lav THOP1 ekspresjon ble funnet i 71 (59,2%) av 120 tumorprøver. I tillegg, som negative kontroller, farging uten primære antistoffer resulterte i ingen farging. Som vist på fig. 2, THOP1 ble sterkt uttrykt i cytoplasma av normale bronkiale epitelceller og pneumocytes. Høy THOP1 ekspresjon ble funnet i 31 (58,5%) av de 53 normalt lungevev og lav THOP1 ekspresjon ble funnet i 22 (41,5%) av de 53 normalt lungevev. Uttrykket av THOP1 var signifikant høyere i normal lunge vev enn i NSCLC prøvene (chi-kvadrat test,
P
= 0,032).
Ulike intensiteter av THOP1 protein uttrykk i adenokarsinom, negativ uttrykket (A), med svak (B), moderat (C), og sterk (D) ekspresjon. Ulike intensiteter av THOP1 protein uttrykk i plateepitelkreft, negativt uttrykk (E), med svak (F), moderat (G), og sterk (H) uttrykk.
Forholdet mellom THOP1 protein uttrykk og clinicopathologic faktorer ble undersøkt av chi-kvadrat test, og våre data viste at lavere THOP1 uttrykk var signifikant korrelert med positiv lymfeknutemetastase (
P
= 0,048). Det var ingen statistisk signifikans i relasjoner mellom THOP1 uttrykk og andre clinicopathologic variabler (
P
0,05, tabell 1).
For å undersøke uttrykket av THOP1 genet i NSCLC, brukte vi kvantitativ real -time PCR for å måle ekspresjonen av THOP1 mRNA-nivåer i 16 par av primære tumorer og tilsvarende normale vev. Sammenlignet med de tilsvarende normale vev, hadde NSCLC-prøvene ble redusert THOP1 mRNA ekspresjon (figur 3A). Konsekvent, viste western blotting analyse at 12 av 16 NSCLC prøvene hadde sunket THOP1 protein uttrykk i forhold til de tilsvarende normalt vev (Figur 3B).
A. Ekspresjon av mRNA THOP1 i NSCLC-vevet var lavere enn det i den normale lunge vev (
P
0,01). B. Western blot-analyse antydet at NSCLC-prøvene hadde sunket THOP1 protein ekspresjon sammenlignet med tilsvarende normale vev. N: Normal lungevev, T:. NSCLC prøvene
2. Univariat og multivariat overlevelsesanalyse for 5-års sykdomsfri overlevelse
Tumor tilbakefall utvikles innenfor oppfølgingsperioden på 82 (68,3%) av de 120 pasientene: lokalt tilbakefall hos 18 pasienter, fjernmetastaser hos 52 pasienter , og både lokale tilbakefall og fjernmetastaser hos 12 pasienter. Univariat analyse (log-rank test) viste at lav THOP1 uttrykk (25,4% versus 40,8%,
P
= 0,038, figur 4A) betydelig spådd redusert 5-års sykdomsfri overlevelse. Videre resultatene av multivariat Cox regresjonsanalyse viste at lav THOP1 uttrykk beholdt sin betydning som en selvstendig prognostisk faktor for ugunstig 5 års sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,046, Tabell 2).
3. Univariat og multivariat overlevelsesanalyse for 5-års overlevelse
Av de 120 pasienter, 73 (60,8%) tilfeller døde av kreft-relaterte årsaker i løpet av 5 år etter operasjonen, 5-års overlevelse var 39,2%. Univariat analyse (log-rank test) viste at lav THOP1 uttrykk (29,6% versus 53,1%,
P
= 0,017, figur 4B), positiv lymfeknutemetastase (29,0% versus 50,0%,
P
= 0,025, figur 4C) og avansert TNM stadium (30,1% versus 53,2%,
P
= 0,009, figur 4D) betydelig spådd dårlig fem års total overlevelse (tabell 3). Resultatene av multivariat Cox regresjonsanalyse viste at den betydelige effekten av prognostisk positiv lymfeknutemetastase (
P
= 0,653, tabell 3) og avansert TNM trinn (
P
= 0,218, tabell 3) observert på univariat analyse forsvant, og bare lav THOP1 uttrykk beholdt sin betydning som en selvstendig prognostisk faktor for ugunstig total overlevelse (
P
= 0,021, Tabell 3).
Diskusjoner
Selv om det blir ansett for å spille en rolle i det nevroendokrine system [14], THOP1 har blitt en ny fokus i tumorforskning. Cellefraksjoneringsstudier har vist at THOP1 er til stede i de partikkelformige subcellulære fraksjoner av det sentrale nervevev [15] og skilles fra særegne cellelinjer, slik som rotte C6 glioma [16] og mus att-20 [17]. Videre ble høy THOP1 mRNA uttrykk i tilsvarende normalt vev av leverkreft (HCC) korrelert med en bedre total overlevelse [11]. Imidlertid har få studier påvist uttrykk for THOP1 protein i tumorvev og dens forhold til tumor prognose.
I denne studien undersøkte vi uttrykket av THOP1 i NSCLC og tilsvarende normalt vev, og deretter analysert relasjoner mellom THOP1 uttrykk og andre clinicopathologic variabler i NSCLC. Funnene i vår studie viste at THOP1 ble allment uttrykt i NSCLC og tilsvarende normalt vev, og uttrykk for THOP1 i normale vev av NSCLC ble signifikant forhøyet i både mRNA og proteinnivåer. I tillegg ble lavere THOP1 ekspresjon i NSCLC signifikant korrelert med positiv lymfeknutemetastase. Kaplan-Meier analyse i denne studien viste at lav THOP1 uttrykk betydelig spådd redusert 5-års sykdomsfri overlevelse og total overlevelse. I tillegg er positiv lymfeknutemetastase og avansert stadium TNM signifikant predikerte redusert 5-års overlevelse. For å eliminere virkningen av blandet faktorer korrelert med prognose på statistisk analyse, ble det Cox regresjon multivariat analyse utføres for å bestemme uavhengige prognostiske faktorer. Multivariat analyse viste at bare THOP1 beholdt sin prognostisk verdi som uavhengig prognostisk faktor for dårlig sykdomsfrie og total overlevelse. Vår overlevelsesanalyse viste at ekspresjon av THOP1 protein kan være et nyttig diagnostisk markør for pasienter med NSCLC. Som nevnt ovenfor, resultatene antydet at THOP1 proteinet kan ha en antitumoreffekt på karsinogenese og tumorprogresjon av NSCLC.
Forrige studie antydet at THOP1 var i stand til å hydrolysere flere typer bioaktive peptider slik som bradykinin (BK) [ ,,,0],18]. BK er en viktig mediator ansvarlig for tumor-assosiert angiogenese og tumorvekst [19], [20], [21]. I tillegg ble BK involvert i karsinogenese og progresjon av kreft ved å øke α2β1 integrin ekspresjon via BK reseptor signalveien [22]. Dessuten, som en antagonist faktor til BK, kunne THOP1 hemme angiogenese og tumorvekst fremmet av BK [12]. Patologisk angiogenese er et forholdsvis tidlig begivenhet i karsinogenese og økt tumor angiogenese er korrelert med tumorinvasjon, metastase og dårlig prognose [23], [24]. Derfor, redusert uttrykk for THOP1 i NSCLC kan være ansvarlig for kreftutvikling, malignitet og dårlig overlevelse på grunn av sin reduksjon i anti-BK funksjon.
Spennende fremgang har blitt gjort i å bruke THOP1 for immunterapi i kreft. Det ble rapportert at THOP1 utskilt av tumorceller var en meget sannsynlig kandidat til ekstracellulære aktivering av KPI-0004Na som var en prodrug av doxorubicin, og forbedret terapeutisk indeks av KPI-0004Na sammenlignet med fri doksorubicin ble bekreftet i tre tumor xenograft modeller av prostata, bryst, og lungekreft [10], [25]. En annen studie om cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) foreslo THOP1 kan styrke immunforsvaret mot intracellulære patogener og kreft ved å bidra til C-terminal trimming av CTL-epitoper [26]. Derfor kan THOP1 ha klinisk potensiale til å bli anvendt som et mer nyttig middel for antitumorterapi for pasienter med NSCLC.
Som konklusjon, vår retrospektiv analyse gitt bevis for at ekspresjon av THOP1 var betydelig høyere i de normale lungevev enn det i NSCLC-prøver, og lav THOP1 ekspresjon ble signifikant korrelert med positiv lymfeknutemetastase i NSCLC. Videre har høy THOP1 protein ekspresjon oppviste antitumor eiendom og viste positiv innflytelse på både sykdomsfri og total overlevelse. Derfor kan THOP1 ha klinisk potensiale til å bli anvendt som et lovende biomarkør for å identifisere individer med bedre prognose og et nytt antitumormiddel for behandling av pasienter med NSCLC.
