Abstract
Mål
For å kartlegge omfattende metylering status av CPG områder innenfor HPV16 lang kontrollområdet (LCR) i HPV-positive kreftceller, og for å utforske videre effekten av metylering status for HPV16 LCR på celle bioaktivitet og E6 og E7 uttrykk. I tillegg til å analysere metylering status for LCR i HPV-positive i munnhule og svelg plateepitelkarsinom (OPSCC) pasienter.
metoder og materialer
metylering mønstre av HPV16 LCR i UM-SCC47, CaSki og Siha celler og HPV16-positiive OPSCC prøver ble detektert ved bisulfitt-sekvensering av PCR og TA kloning. For celler behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin og E6 og E7 knockdown, MTS og trypanblått-farving, annexin-V og 7-AAD-farging, og prodidium jodid ble brukt for å vurdere cellevekst og celleproliferasjon, celle apoptose, og cellesyklus arrest, henholdsvis. E6 og E7 mRNA og protein uttrykk ble analysert ved kvantitativ real-time PCR og immunocytochemistry hhv.
Resultater
Hypermethylation status for LCR i UM-SCC47 (79,8%) og CaSki celler ( det ble ikke observert 90,0%) og unmethylation status for LCR i Siha celler (0%). Ved demetylering, cellene med forskjellige nivåer metylering reagert på en annen måte under vekst, apoptose og cellesyklus-stans, så vel som i form av deres E6 og E7 uttrykk. I HPV16-positive pasienter OPSCC, metylering ratene var 9,5% i hele LCR-regionen, 13,9% i den 5′-LCR, 6,0% i E6 enhancer, og 9,5% i p97 promoter, og hypermethylation av p97 promoter ble funnet i en undergruppe av tilfellene (20,0%, 2/10).
Konklusjoner
Vår studie viste to forskjellige metylering nivåer av LCR i HPV16-positive kreftceller og OPSCC pasienter, som kan representere forskjellige karsinogenisitetsstudier mekanismer for HPV-positive kreftceller. Demethylating de meCpGs i HPV16 LCR kan være et potensielt mål for en undergruppe av HPV16-positive pasienter med hode og hals plateepitelkarsinom
Citation. Zhang C, Deng Z, Pan X, Uehara T, Suzuki M, Xie M (2015) Effekter av Metylering Status for CpG nettsteder innenfor HPV16 lange kontroll Region med HPV16-Positive hode og nakke kreft celler. PLoS ONE 10 (10): e0141245. doi: 10,1371 /journal.pone.0141245
Redaktør: Scott M. Langevin, University of Cincinnati College of Medicine, USA
mottatt: 5 mai 2015; Godkjent: 05.10.2015; Publisert: 28 oktober 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China, (81372477 til MX); (https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/), Japan Society for Promotion of Science (KAKENHI 26462610 til MS og KAKENHI 26462611 til ZD); (https://www.jsps.go.jp/english/), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning, Kina (20114433110001 til MX); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm), Foundation Natural Science i Guangdong-provinsen, Kina (2014A030310411 til ZD), (https://www.gdstc.gov. cn /eng /mission.html), og et stipend fra Science and Technology Development Center, Ministry of Education of China (20134433120021 til ZD); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vedvarende infeksjon med høyrisiko humant papillomavirus (HPV) er etablert som en etiologisk faktor i tillegg til overdreven tobakk og alkoholforbruk for hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [1-4]. Dette gjelder i munnhule og svelg plateepitelkarsinom (OPSCC) spesielt; 50-70% av OPSCC pasienter er smittet med HPV16 [2-7]. E6 og E7 er de to viktigste virus teinene er ansvarlig for vedlikehold av HPV-mediert malign transformasjon gjennom sitt samspill med flere viktige cellulære proteiner, slik som p53 og pRb [8,9]. E2 protein kan bidra til flere biologiske prosesser, inkludert viral transkripsjon og viral DNA replikasjon [10-13], og indusere vekststans og celle apoptose via dens virkning på ekspresjon av E6 og E7 og andre virale proteiner [14-16]. Alle disse aktivitetene av E2 er avhengig av dets evne til å binde seg til den virale DNA genom, særlig den tidlige promoter p97 ved spesifikke E2-bindingsseter (E2BSs) som befinner seg innenfor den lange kontrollområde (LCR) i HPV-genomet [15,17] . Enhancer, lokalisert ved 5′-enden av det p97-promoteren, også bidrar til regulering av E6 og E7 uttrykk [12].
Tidligere studier har vist integrering av virale genomer i vertsgenomet er ofte forbundet med forstyrrelse av E2-genet, som fører til ukontrollert uttrykk av E6 og E7 teinene [15,18,19], Wilson et al fant betydelig berikelse av potensielle integrerings nettsteder innenfor E2 regionen, noe som tyder på at E2 var også en felles plassering av avbrudd ved integrering i vertsgenomet i HNSCC [19]. Men en rekke studier viser at mange ondartede HPV-assosiert karsinomer mangler integrerte viral genom kopier eller inkluderer integrert virale genomer ledsaget av episomale virale genomer. Selv om noen virale genomer er fullt integrert, kan E2-genet være intakt og flere kopier av HPV genomet beholdes i tandem arrays, også kalt «concatemers», slik som den HPV16-infiserte CaSki cellelinje [20]. Forsøk har således blitt gjort for å forstå andre mekanismer, herunder metylering eller sekvens variasjoner i LCR, som regulerer E6 og E7 uttrykk [7,21,22].
DNA metylering refererer til overføring av en metylgruppe til cytosinrestene som vanligvis fører til genet Slå ved enten fysisk å inhibere bindingen av transkripsjonsfaktorer eller kromatinstruktur remodellering [15,23]. Metyleringen status for HPV16-genomet, som inneholder 15 dinukleotid CpG områder i LCR, i livmorhalskreft cellelinjer og kliniske prøver har blitt analysert, men rollene til HPV-genomet metylering i karsinogenese forblir uklar [24-29]. Økt metylering av HPV genom er funnet konsekvent på de fleste områder i livmorhalskreft eller høygradig cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) sammenlignet med lav grad av CIN [24,25]. Metylering av HPV genomet har dukket opp som en biomarkør for kreft progresjon i livmorhalskreft [15,24,30,31]. Videre rapporterte noen forskere at hypometylering statusen CaSki celler indusert av en DNA-metylering hemmer redusert cellulær levedyktighet men ikke påvirke bioaktivitet i HeLa celler som inneholder en helt unmethylated HPV-18 genomet [27], som inspirerte oss til å utforske de potensielle nye effekter av HPV metylering status i HPV-positive kreft.
til dags dato, men det er ingen informasjon om effekten av metylering variasjon og dens reguleringsmekanisme i HNSCC celler. Dessuten, siden metylert CpG (meCpG) er potensielt reversible, demethylating de meCpGs av HPV genomet kan være et verdifullt mål for kreftbehandling. For å fylle dette gapet i kunnskap, benyttet vi HNSCC celler for første gang for å kartlegge omfattende metylering status av CPG områder innen LCR, og å utforske videre effekten av demethylating HPV16 LCR på celle bioaktivitet og E6 og E7 uttrykk. I tillegg svært få studier undersøkt HNSCC prøver og resultatene er inkonsistente [19,32,33]; vi viste derfor metylering status for LCR i HPV-positive OPSCC pasienter.
Materialer og metoder
Cell kultur og 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dc) behandling
HNSCC cellelinje UM-SCC47, som ble utviklet fra en pasient med lateral tungen kreft [34] (en gave fra professor Thomas E. Carey, University of Michigan) og livmorhalskreft cellelinjer CaSki ( ECACC, Salisbury, UK) og Siha (ATCC, Tokyo, Japan) ble karakterisert i denne studien (tabell 1). En integrert HPV16-genomet ble detektert i UM-SCC47, CaSki, og Siha cellelinjer, som inneholder 15, 600, og 1-2 kopier av HPV16-genomet, henholdsvis [35,36]. Cellene ble dyrket i RPMI1640 (for UM-SCC47 og CaSki) eller EMEM (for Siha) inneholdende 10% føtalt bovint serum og 100 IU /ml penicillin /streptomycin. Demetyleringen reagens 5-aza-dc (Sigma, St. Louis, MO) ble oppløst i DMSO ved 50 mM og lagret i alikvoter ved -80 ° C inntil bruk. Eksponentielt voksende celler ble behandlet med 5-aza-dc ved forskjellige konsentrasjoner (0,1-5 uM) i 72-120 timer. Dyrkingsmediet inneholder nylaget 5-aza-dc ble erstattet hver 24 timer.
kliniske prøver
tumorvev ble samlet fra pasienter behandlet ved Institutt for otolaryngologi, leder og Neck Surgery, University of the Ryukyus mellom desember 2008 og mai 2011. etikkutvalg ved Universitetet i Ryukyus spesielt godkjent denne studien, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. HPV16 infeksjon ble bestemt ved hjelp av PCR-amplifikasjon og sekvensering som tidligere rapportert [5,37]. Prøver fra 10 representative OPSCC pasienter med HPV16 infeksjon ble undersøkt i denne studien (tabell 2).
Bisulfite modifikasjon, PCR forsterkning, TA kloning, og DNA-sekvensering
DNA-ekstraksjon fra celler og vevsprøver ble utført ved hjelp av en Gentra Rensing Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) som rapportert tidligere [5], og DNA (1-2 mikrogram) var sulfitt-omregnes en EpiTect
® Plus bisulfite Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens protokoll.
den modifiserte DNA ble forsterket i 3 amplikonene med bisulfitt-sekvensering PCR (BSP) primer analyser og betegnes BSP-en, BSP-2, og BSP-3 (S1 Bord). For UM-SCC47 og noen vevsprøver som var negative på PCR forsterkning ved bruk av primer setter BSP-en eller BSP-2, vedtok vi primer setter BSP-5 og BSP-6 i stedet (S1 tabell). BSP ble utført i et 25 ul volum inneholdende 0,2 mM av hver av de 4 dNTP, 2 mM MgCl
2, 10 pmol av hver primer, 1,25 enheter AmpliTaq DNA-polymerase (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), og 300 ng sulfitt-modifiserte DNA. BSP Betingelsene var 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 45 sykluser ved 95 ° C i 1 minutt, 54 ° C i 1 min, og 72 ° C i 2 minutter, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. Som rapportert tidligere [5], ble PCR-produktene renset ved hjelp av en veiviser
® SV Gel og PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI) og deretter klonet inn i pCR ™ 4-TOPO
® vektor (Invitrogen , Carlsbad, California) for sekvensering. For hvert fragment ble minst 6 individuelle kloner sekvensert ved hjelp av en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Metylering spesifikk PCR
Nøstet PCR ble utført for å analysere den generelle metylering status for LCR og metylering variasjon etter demetylering behandling. Primere som brukes for nestet PCR er vist i S1 tabell, og deres produkter dekker 7 denaturert /unmethylated (M /U) CpG steder i 5′-LCR og forsterker regionen. Bisulfitt-modifiserte DNA ble først amplifisert ved PCR med BSP-6 primersett. BSP ble utført i et 25 ul volum inneholdende 0,2 mM av hver av de 4 dNTP, 2 mM MgCl
2, 10 pmol av hver primer, 1,25 enheter AmpliTaq DNA-polymerase (Applied Biosystems), og 100 ng bisulfitt-modifisert DNA. BSP Betingelsene var 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 25 sykluser ved 95 ° C i 60 s, 54 ° C i 60 s, og 72 ° C i 2 minutter, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. Da produktet fra den første runden av PCR ble underkastet en andre runde med amplifisering ved hjelp av metylering-spesifikk PCR primersett (S1 Table), kan så denaturert og unmethylated sekvenser forsterkes hver for seg. PCR ble utført i et 20 ul volum inneholdende 0,2 mM av hver av de 4 dNTP, 2 mM MgCl
2, 10 pmol av hver primer, 1,0 enhet AmpliTaq DNA-polymerase (Applied Biosystems), og 3 ul produkt av første runde med BSP. PCR-betingelsene var 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 25 sykluser med 95 ° C i 40 s, 58 ° C i 40 s, og 72 ° C i 1 min, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min.
knockdown av E6 og E7
Silencer
® Velg siRNA rettet mot HPV16 E6 og E7 (5′-GUA UGG AAC AAC AUU AGA A-3), Silencer
® siRNA målretting GAPDH (positiv kontroll), og egge siRNA (negativ kontroll) ble oppnådd fra Ambion (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). For siRNA transfeksjon ble cellene sådd ut i 6-brønns plater (1,0 x 10
5 celler /brønn). Etter over natten utvinning, ble cellene transfektert individuelt med 60 nM siRNA bruker en Lipofectamine RNAiMax
® Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble utsatt for total RNA ekstraksjon ved 72 timer etter transfeksjon, og veksthemming, apoptose og cellesyklus-stans ble analysert ved 96 timer etter transfeksjon.
Påvisning av proliferasjon og apoptose, og cellesyklusanalyse
For å oppdage veksthemming etter demetylering behandling, ble cellene sådd i tre eksemplarer i 96-brønners plater (1500 celler /brønn). Etter over natten utvinning ble cellene behandlet fortløpende med nylaget 5-aza-dc fra dag 1 til dag 7. celle proliferasjon ved forskjellige tidspunkter ble målt ved anvendelse av en CellTiter 96
® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega , Madison, WI) og absorbans (OD 490 nm) ble målt ved anvendelse av en microreader (SH-1000, Wakenyaku, Kyoto, Japan). Etter knockdown av E6 og E7, vi hovedsakelig fokusert på hemming av spredning på 96 timer. Således, benyttet vi trypan blå eksklusjon for hemming av cellevekst etter siRNA. Cellene ble sådd ut i triplikat i 6-brønns plater (1,0 x 10
5 celler /brønn). 96 timer etter transfeksjon av sirnas ble cellene fjernet og farget med 0,4% trypanblått-oppløsning, og den veksthemming hastigheten kan bestemmes ved å telle og sammenligning av fargestoff-eksklusiv-celler mellom gruppene transfektert med egge siRNA eller siRNA målretting E6 eller E7 . Dessuten kunne de døde celler etter tap av E6 og E7 sammenlignes mellom ulike grupper
For å vurdere graden av apoptose, annexin-V og 7-AAD flekker. (Guava nexin Reagens Millipore, Hayward, CA) ble undersøkt av flowcytometri (Guava EasyCyte Plus Flowcytometer Millipore). Cellene ble sådd ut i 6-brønns plater (1,0 x 10
5-celler /brønn). Etter over natten utvinning, ble cellene behandlet med 5-aza-dc eller transfektert med siRNA som beskrevet ovenfor. I henhold til produsentens instruksjoner, ble log av annexin-V-PE og 7-AAD vist på x- og y-aksene til cytogram, respektivt. Annexin-V-positive celler plottet i nedre høyre og øvre høyre kvadrant ble evaluert så tidlig apoptotiske celler og sent apoptotiske /døde celler, henholdsvis.
Cellesyklus analyse ble utført med propidiumjodidfarging å bestemme DNA innhold . Cellene ble behandlet med 5-aza-dc eller transfektert med siRNA som beskrevet ovenfor. Etter oppsamling av dyrkningsmediet, ble cellene vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og frittliggende. Den frittliggende og flytende celler i kulturmediet og PBS ble oppsamlet ved sentrifugering. Etter kaste supernatanten og fikse celler med iskald etanol, ble cellene farget med Guava cellesyklusen reagent og data ble anskaffet ved hjelp av en Guava EasyCyte Plus Flowcytometer. Modfit LT ™ 4.0-programvare (Verity Software House, Topsham, ME) ble brukt til å analysere cellesyklus resultater.
kvantitativ real-time PCR
For å oppdage E6 og E7 uttrykk etter 5-aza -DC behandling eller E6 og E7 knockdown, ble total RNA ekstrahert fra cellene og omdannet til cDNA som tidligere er rapportert [36]. β-Actin ble vedtatt som en intern kontroll; β-aktin, E6 og E7 ble forsterket ved hjelp av ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) og TaqMan
® PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Foster City, CA) som beskrevet tidligere [32,36] . De relative uttrykk for E6 og E7 ble beregnet som E6 /β-aktin og E7 /β-aktin.
Immunocytochemistry
Cellene ble sådd i 6-brønns plater med steriliserte Dekk nederst av brønnen og behandlet med 5-aza-dc, som beskrevet ovenfor. Etter at cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur, ble objektglassene blokkert med 3% H
2o
2 i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble de dekkunderkastet inkubering over natten ved 4 ° C med en primær anti-HPV16-E6-antistoff (C1P5, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) eller anti-HPV16-E7-antistoff (ED17, 1: 100 ; Santa Cruz Biotechnology). Cellene ble vasket med PBS og inkubert med et pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-muse-sekundært antistoff (MTM Laboratories AG, Heidelberg, Tyskland) i 30 minutter ved romtemperatur. Seksjonene ble så farge utviklet i 3,3′-diaminobenzidin for 3 min og kontra med hematoksylin.
Statistisk analyse
Sammenligning av to grupper ble utført ved hjelp av t-test eller ikke- parametriske tester. Forskjellen i frekvens mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av Pearsons χ
2-test eller Fishers eksakte test. Assosiasjonene mellom metylering status og virusmengde, og E2 /E6 hastighet ble analysert ved Spearman rang korrelasjon. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske tester var tosidig, og alle analyser ble utført med SPSS programvare v12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
Ulike LCR metylering mønstre i HPV16- positive kreft cellelinjer
i alt 15 CpG steder innen LCR av HPV16 genomet, som er rik på regulatoriske elementer, ble undersøkt i denne studien (figur 1A og S1 fig). Så dette var den første undersøkelse av LCR av UM-SCC47 celler anskaffet vi LCR-sekvensen ved PCR ved anvendelse av 3 primersett, det vil si, LCR-1, -2 og -3, som vist i tabell S1. Siden to nukleotid (nt) mutasjoner (nt7435 og nt31) forandret av tilstedeværelsen av CpG steder (fig 1B og 1C, og S1 figur), ble bare 13 CpG sider vurdert i UM-SCC47 celler (S1 Fig). I denne studien, UM-SCC47 og CaSki-celler viste hypermethylation i LCR (79,8% og 90,0%, henholdsvis) (figur 2A og 2B). CPG nettsted (nt7862) ligger innenfor E2BS-2 var relativt hypomethylated (37,5% i UM-SCC47 og 12,5% i CaSki), mens CPG områder innenfor E2BSs andre enn nt7862 ble hypermethylated i UM-SCC47 (97,9%) og CaSki (100%) celler. I motsetning alle CpG områder innenfor LCR i Siha celler var unmethylated (0/120) (figur 2C). Således kunne Siha celler bli brukt som en negativ kontroll for videre undersøkelser av demetylering av meCpG områder.
A) Strukturen av HPV16 LCR og plassering av CPG-områder. Transkripsjonsfaktor bindingsseter er også vist. B, C) Nukleotidstørrelser mutasjoner ved nt7435 (G → A) og nt31 (C → T) av UM-SCC47 celler påvirkes av tilstedeværelsen av CPG nettstedene.
Åtte individuelle kloner ble sekvensert for å identifisere nærvær og endringen av hver enkelt metylert CpG-dinukleotid før og etter demetylering indusert av 0,5 uM 5-aza-dc i 96 h i A) UM-SCC47, B) CaSki, og C) Siha celler. Fylte sirklene representerer denaturert CPGs (meCpGs), åpne sirkler representerer unmethylated CPGs, og stjernene representerer fravær av CPG nettsteder. D) metylering av CpG nettsteder i vev. For hver CpG område, ble 6 kloner sekvensert for å identifisere tilstedeværelsen og hyppigheten av meCpG kloner. Prosentene av meCpG kloner er indikert ved venstre loddrett strek. På bunnen av figuren, er posisjonene av CPG områder merket.
5-Aza-dc induserer CpG hypometylering innenfor LCR i UM-SCC47 og CaSki celler
Som en sterk demetylering reagens, 5-aza-dc har vist terapeutiske effekter på hematologiske ondartede sykdommer og noen faste tumorer, inkludert HNSCC [38]. I denne studien, behandling med 0,5 mikrometer 5-aza-dc for 96 timer viste optimal demetylering potens (0,1-5 mikrometer testet) (S2 figur).
Etter 0,5 mikrometer 5-aza-dc behandling, forekomst av meCpGs innenfor LCR i UM-SCC47 og CaSki celler var betydelig redusert til 19,2% (20/104; P 0,001) og 29,2% (35/120; P 0,001), henholdsvis, mens ingen endring ble funnet i Siha celler (0%, 0/120) (fig 2). Interessant, i UM-SCC47 celler behandlet med 5-aza-dc, ikke bare var meCpGs i promoterregionen demetylert vesentlig mer enn i den 5′-LCR og forsterker region (P = 0,038), men også meCpGs innenfor E2BSs hadde signifikant større demetylering variasjon (P = 0,025).
LCR demetylering reduserer E6 og E7 uttrykk i UM-SCC47 og CaSki celler
Ved demetylering behandling med 0,5 mikrometer 5-aza-dc i 96 timer, ekspresjon av E6 og E7 mRNA ble signifikant redusert i UM-SCC47 (P = 0,021 og P = 0,008, respektivt) og CaSki-celler (P = 0,017 og P = 0,023, respektivt), men ikke i Siha celler (figur 3A og 3B ). Videre, vi har oppdaget E6 og E7 proteiner i UM-SCC47 og CaSki celler ved immunocytochemistry. E6- og E7-proteinene ble lokalisert i cytosol og kjernen av UM-SCC47 og CaSki-celler, og prosentandelen av fargede celler og fargeintensitet ble signifikant redusert etter demetylering (figur 3C og 3D).
Demetylering av CpG områder indusert av 0,5 uM 5-aza-dc i 96 timer sank E6 og E7 ekspresjon, noe som ble påvist ved revers transkripsjon PCR A) og kvantitativ real-time PCR B); E6 og E7 ble tydelig redusert i UM-SCC47 og CaSki celler, men det var ingen åpenbare endringen i Siha celler. Verdiene (gjennomsnitt ± SD) ble oppnådd fra minst 3 uavhengige eksperimenter. C) E6 og D) E7 protein etter demetylering av CPG-setene ble detektert ved immunocytokjemi; E6 og E7 oncoproteiner ble fordelt i cytoplasma og cellekjernen av UM-SCC47 og CaSki-celler med en sterk fargeintensitet (x 100, bar = 100 pm), og både de prosentandeler og intensiteten av fargede celler ble tydelig redusert etter demetylering (x 100 , bar = 100 nm).
Hypomety-lering av HPV16 LCR reduserer celleproliferasjon, øker apoptose, og induserer cellesyklus arrest i UM-SCC47 og CaSki celler
for å undersøke om demetylering av HPV16 LCR med 5-aza-dc påvirker celle bioaktivitet, analyserte vi spredning, apoptose, og cellesyklus arrest. Vekst og fysikalske egenskaper av alle 3 cellelinjer ble ikke åpenbart endret i 2 dager etter 5-aza-dc behandling. Imidlertid 4 dager etter behandling, er veksten av UM-SCC47 og CaSki-celler ble nesten fullstendig inhibert (figur 4A), som var i overensstemmelse med den optimale behandlingsvarighet og påfølgende tap av E6 og E7 uttrykk. Veksthemming av Siha cellene som resulterer fra 5-aza-dc behandling ble også observert, noe som kan være forbundet med cytotoksisiteten av 5-aza-dc indusert av den akkumulerte inkorporering i cellulært DNA [39]; Effekten var beskjedent sammenlignet med CaSki og UM-SCC47-celler (figur 4A).
A) Etter demetylering av CPG-områder, ble celleveksten sterkt hemmet i UM-SCC47 og CaSki-celler, men ikke i Siha celler. B) E6 og E7 uttrykk ble betydelig redusert etter siRNA transfeksjon. C) Cellevekst ble hemmet på 96 timer etter E6 og E7 knockdown. Alle data er midler ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter i A) og C), og betyr ± SD fra 3 uavhengige eksperimenter i B).
apoptotiske celler ble kvantifisert ved annexin-V-PE flekker og flowcytometri. Med demetylering av meCpGs med 5-aza-dc behandling, ble de apoptotiske priser av UM-SCC47 og CaSki celler betydelig høyere (P = 0,026 og p = 0,001, henholdsvis). Dessuten, 5-aza-dc økt antall UM-SCC47 og CaSki-celler arrestert i S-fasen (P = 0,048 og P = 0,003, respektivt), og G2 /M fase (P = 0,002 og P = 0,044, henholdsvis) (figur 5). I motsetning i Siha celler, som har et enkelt unmethylated HPV genom, ingen vesentlige endringer i apoptose eller cellesyklus arrest på S og G2 /M faser ble observert (figur 5).
A) Etter demetylering av CpG områder, hvor mange apoptotiske celler økte signifikant i UM-SCC47 og CaSki-celler, men ikke i Siha celler. B) Etter at demetylering av CPG områder, antall celler arrestert i både S- og G2 /M fase økes i UM-SCC47 og CaSki-celler, men ikke i Siha celler. Alle data er midler ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter.
Cell bioaktivitet endringer etter demetylering behandling er assosiert med tap av E6 og E7 uttrykk
For å finne ut om den biologiske endringer følgende 5-aza-dc behandling var assosiert med tap av E6 og E7 ekspresjon forårsaket av demetylering, transfektert vi de 3 cellelinjer med siRNA å slå ned E6 og E7 (figur 4B). 96 timer etter transfeksjon, ble veksten av UM-SCC47, CaSki, og Siha celler inhiberes (P = 0,044 P = 0,006 og P = 0,022, henholdsvis) (figur 4C); Videre, apoptose (P = 0,026 P = 0,050 og P = 0,016, respektivt) og G2 /M fase rest (P = 0,027 P = 0,035 og P = 0,012, respektivt) ble fremkalt (figur 6). Dette funn var i overensstemmelse med effekten på celler etter demetylering. Våre resultater tyder på at kan være forårsaket betydelige bioaktivitet endringer etter 5-aza-dc behandling av nedsatt E6 og E7 uttrykk forårsaket av meCpG demetylering. Imidlertid bør det bemerkes at den dramatiske vekstinhibering etter transfeksjon antydet E6 /E7 siRNA muligens måtte off-target-effekter.
A) Antallet av apoptotiske celler økte til 96 timer etter E6 og E7 knockdown i UM -SCC47, CaSki, og Siha celler. Cellene ble arrestert i G2 /M fase B) UM-SCC47 og C) CaSki celler, og i begge G2 /M og S faser i D) Siha celler. Alle data er midler ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter.
Ulike metylering mønstre i HPV-positive OPSCC pasienter
Vi har samlet prøver av 10 OPSCC pasienter med HPV16 infeksjon for analyse av deres LCR metylering mønstre (tabell 2). Den midlere metyleringen satsen i 10 prøvene var 9,5% for hele LCR-regionen, 13,9% i den 5′-LCR, 6,0% i E6 enhancer, og 9,5% i p97-promoteren (figur 2D). Mer enn 70% av CpG nettsteder (111/150) var helt unmethylated, mens 26,0% (39/150) ble heterogent metylert (≥ 1 meCpG klone). Alle CpG kloner var unmethylated på nt7862, som er i tråd med den klare hypometylering status i UM-SCC47 og CaSki celler. Men på de andre CpG områder, ble minst en meCpG klone oppdaget.
Selv om størrelsen på utvalget var relativt lite, utførte vi videre analyse og klassifisert metylering profiler som hypermethylation og hypometylering. To pasienter med kreft tonsill- (OPSCC-1 og OPSCC-10) hadde en hypermethylation status (41,6% og 40,0%, henholdsvis) i p97-promoteren. Men i de andre pasientene, bare sporadiske meCpG kloner eller alle unmethylated CpG kloner ble oppdaget, og den gjennomsnittlige metylering rente var 4,1% (24/585). Den distinkte metylering profiler i OPSCC pasientene var svært lik de metylering typer i HPV-positive kreftcellelinjer. Videre analyserte vi forholdet mellom metylering status og virusmengde (E6 eksemplarer), og E2 /E6 hastighet [36]. Etter eksklusjon 2 tilfeller (OPSCC-5 og OPSCC-7) med utliggere i spredningsdiagram, ble metylering frekvensen av p97 arrangøren positivt korrelert med E2 /E6 rate (r = 0,759, p = 0,029). Men ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom metylering frekvensen av p97 arrangøren og virusmengde (P = 0.220).
Diskusjoner
Tidligere studier av HPV16 LCR metylering var i hovedsak basert på livmorhalsen og kliniske prøver. Ved rekombinasjon med det cellulære genom, kan metylering status for HPV16-genomet endres og avhengig av typen av integrasjonen arrangement og sannsynligvis virusmengde [30]. I denne studien ble HPV16 LCR hypermethylated i livmor CaSki celler med tandem integrert HPV16 genomet (en type 2 inte) og unmethylated i Siha celler med integrering av individuelle HPV16 genomer (en type 1-inte). Disse funnene er i tråd med resultatene fra tidligere studier [7,15,25,32]. Vi først identifisert HNSCC UM-SCC47 celler inneholdende et intakt E2-gen av HPV16-genomet og et hypermethylated LCR som cervical CaSki-celler, hvori HPV genomer er integrert i det cellulære genomet i tandem matriser [20]. Den metylering av E2BSs i HPV16 LCR var korrelert med uttrykket nivået av onkogene E6 og E7, og demetylering av HPV16 LCR i UM-SCC47 celler trykt E6 og E7 uttrykk, hemmet spredning, og til slutt forårsaket cellesyklus arrest i G2 /M. Våre funn tyder på at metylering innen HPV16 LCR spiller også en viktig rolle i den virale livssyklus i HNSCC celler som inneholder en type 2 inte HPV16 genom. Videre kan metylering også tolkes som et alternativ forsvarsmekanisme for å slå av viral replikasjon og transkripsjon [40], som kan representere en ny mekanisme ved hjelp av hvilken HPV-genomet er konvertert fra en produktiv infeksiøst middel til en ny karsinogen.
Det har vist seg at fullstendig denaturert HPV16-genomet er transkripsjonelt inaktiv [41] og tidligere studier antydet at tunge metylering ikke er nødvendig for LCR E2BSs å påvirke p97 promoter-aktivitet [27,42]. Undertrykkelse av promoteren kan gjenopprette de normale funksjonene til p53 og pRb, samt andre mål for E6 og E7 [43-45]. Videre gjeninnføring av E2 i forbindelse med enten E6 eller E7 under kontroll av et E2-uavhengig promoteren er blitt brukt for å klargjøre ytterligere funksjoner av E6 og E7 i transformerte celler [43,45]. Våre data viste CpG-områdene i den 5′-LCR og promoter-regionen i UM-SCC47 celler, innbefattende alle E2BSs, ble metylert fortrinnsvis, og 5-aza-dc demetylering var mer effektiv for meCpGs i promoterregionen og E2BSs enn andre CpG områder innen HPV16 LCR i UM-SCC47 celler, noe som tyder på at disse viktige områdene og regionen kan være sårbare for metylering i kreftutvikling og demetylering. Imidlertid CpG ved nt7862, som ligger i den linkerområde mellom enhancer og promoter, tendens til å bli hypomethylated i begge UM-SCC47 og CaSki-celler, så vel som OPSCC prøver, med lignende resultater også rapportert tidligere [24,25, 29,30,33]. Dette tyder på at CpG området kan være involvert i den virale replikasjonsorigo og dens unmethylation status er ofte beholdt for å opprettholde den virale livssyklus. Videre studier er nødvendig for å forklare dette fenomen.
Studier har vist at HPV-positive HNSCCs har en bedre respons på radioterapi og /eller kjemoterapi enn HPV-negative HNSCCs [46,47].
