Abstract
Thiacremonone (2, 4-dihydroksy-2, 5-dimetyl-thiophene-3-en) er en antioksidant stoff som en roman svovelforbindelse som genereres fra høy temperatur-High-Pressure-behandlet hvitløk. Peroxiredoxin 6 (PRDX6) er medlem av peroxidases, og har glutationperoksidase og kalsium-uavhengig fosfolipase A2 (iPLA2) aktiviteter. Flere studier har vist at PRDX6 stimulerer lungecancer-cellevekst ved hjelp av en økning av glutation-peroksydase-aktivitet. En docking modellstudie og trekke ned analysen viste at thiacremonone helt passer på det aktive området (cys-47) fra glutationperoksidase av PRDX6 og samhandler med PRDX6. Således undersøkte vi hvorvidt thiacremonone hemmer celleveksten ved å blokkere glutationperoksidase av PRDX6 i humane lungekreftceller, A549 og NCI-H460. Thiacremonone (0-50 ug /ml) inhiberte kreftcellevekst lunge i en konsentrasjonsavhengig måte gjennom induksjon av apoptotisk celledød fulgt av induksjon av spaltet caspase-3, -8, -9, Bax, p21 og p53, men reduksjon av xIAP , CIAP og BCL2 uttrykk. Thiacremonone ytterligere hemmet glutationperoksidase aktivitet i lungekreftceller. Imidlertid celleveksthemmende virkning av thiacremonone ble ikke observert i de lungekreftceller transfektert med mutante PRDX6 (C47S) og i nærvær av ditiotreitol og glutation. I en allograft in vivo modell, thiacremonone (30 mg /kg) også hemmet tumorvekst sammen med reduksjon av PRDX6 ekspresjon og glutation-peroksydase-aktivitet, men øket ekspresjon av spaltet caspase-3, -8, -9, Bax, p21 og p53 . Disse data indikerer at thiacremonone hemmer tumorvekst via inhibering av glutation-peroksydase-aktivitet av PRDX6 gjennom interaksjon. Disse dataene antyder at thiacremonone kan ha potensielt gunstige effekter på lungekreft
Citation. Jo M, Yun H-M, Park K-R, Park MH, Lee DH, Cho SH, et al. (2014) Anti-Cancer Effekt av Thiacremonone gjennom nedregulering av Peroxiredoxin 6. PLoS ONE 9 (3): e91508. doi: 10,1371 /journal.pone.0091508
Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, USA
mottatt: 16. desember, 2013, Godkjent: 13 februar 2014; Publisert: 11 mars 2014
Copyright: © 2014 Jo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (No. MRC, 2008-0062275). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Peroxiredoxins (PRDXs) er en familie av peroxidases som antioksidant enzymer [1] – [2]. Den PRDX familien omfatter seks medlemmer. De er delt inn i to klasser [3]. Den 2-Cys gruppen omfatter PRDX1-5, mens PRDX6 er bare et medlem av en-Cys gruppe. PRDXs er en familie av peroksydaser som ødelegger peroksider ved hjelp av konserverte cysteinrester i det katalytiske sentrum [4]. Blant de seks pattedyr medlemmer av denne familien, er PRDX6 det eneste medlemmet som har glutationperoksidase og kalsium-uavhengig fosfolipase A2 (iPLA2) aktiviteter [5]. Mens andre PRDXs utnytte tioredoksin som en fysiologisk reduksjonsmiddel, benytter PRDX6 glutation [6]. PRDX6 beskytter celler fra membranen, DNA, protein skader, og lipidperoksydasjon [7]. Den antioksidanten responselement (ER) i prdx6 promoter-regionen, et
cis
-acting regulator element, aktiveres ved oksidativt stress [8]. Transkripsjon av den PRDX6-genet reguleres ved nukleær faktor erytroid 2-relaterte faktorer 1, 2 og 3 (Nrf1, Nrf2, og Nrf3) som transkripsjonsfaktorer via binding til den ARE [9]. Blant de Nrfs, Nrf2 positivt regulerer transkripsjon av PRDX6 genet [10].
Som PRDXs er antioksidanter, de støtter overlevelse og tumor vedlikehold ved å beskytte cellene mot oksidativt stress-indusert apoptose [11]. I en fersk undersøkelse, over uttrykk for PRDX 6 demper cisplatin-indusert apoptose i humane eggstokkreft celler [12]. I motsetning til dette, reduksjon av PRDX6 ekspresjon øket peroksyd-indusert celledød i leverkreftceller [13]. Den invasjon og metastase fremme handlinger PRDX6 har blitt funnet i lungekreftceller gjennom aktivering av Akt via aktivering av phosphoinositiede 3-kinase (PI3K) og p38 kinase [4], [14]. Aktiviteten av PRDX6 bidrar til metastatisk evne til lungekreftceller ved å stimulere invasjons komponenter, inkludert PI3K, Akt, og uPA [4]. Det ble også rapportert at PRDX6 ekspresjon i lungecancerceller var signifikant assosiert med tumorprogresjon [15].
hvitløk har vært benyttet i tradisjonell medisin som en matvarekomponent for å hindre utvikling av kreft [16]. Thiacremonone (2,4-dihydroxy-2,5-dimetyl-thiophene-3-en) er en antioksidant substans, som en roman svovelforbindelse, generert fra høy temperatur-High-Pressure (HTHP) -behandlet hvitløk [17]. I denne studien undersøkte vi anti-kreft effekt av thiacremonone gjennom hemming av glutationperoksidase aktivitet via samhandling i lungekreftceller.
Materialer og metoder
Utvinning og karakterisering av thiacremonone
strukturen av en svovelforbindelse isolert fra hvitløk (kalt thiacremonone) er vist i resultater (fig. 1A). Hvitløk (Allium sativum L) ble oppvarmet til temperaturer på 130 ° C i 2 timer. De oppvarmede prøver ble juiced og deretter filtrert på en Buchner-trakt under et vakuum. Oppvarmet hvitløk juice ble fordelt etter hverandre i en skilletrakt ved hjelp av etylacetat. Isolering av forbindelsene fra etylacetatlaget av oppvarmet hvitløk juice ble underkastet kolonnekromatografi på silikagel. Denne fraksjon inneholdt thiacremonone ble renset ved preparativ RP-HPLC på en Younglin SP930D Instrument [17]. Thiacremonone ble løst i 0,01% dimetylsulfoksid, og behandles ved konsentrasjoner på 10, 20 og 50 ug /ml i kulturceller.
(A) Oppbygging av thiacremonone, en sulfurcompound isolert fra hvitløk. (B) Rekombinant protein ifølge PRDX6 ble inkubert med thiacremonone-konjugert Sepharose 4B. (C) helcellelysater av NCI-H460 ble inkubert med thiacremonone-konjugert Sepharose 4B. Etter utfelling ble nivåene av bundet PRDX6 overvåket ved Western blot-analyse. (D) Etter utfelling med thiacremonone-konjugert Sepharose 4B ble nivåene av bundet PRDX6 eller mutante PRDX6 C47S overvåket ved Western blot-analyse. (E) Ribbon representasjon docking modell av thiacremonone med PRDX6 (F) Molecular overflaten representasjon docking modell av thiacremonone med PRDX6.
Cell Culture
A549 og NCI-H460 lungekreft celle linjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). CCD-18Co kolon normal cellelinje og normal cellelinje LL24 lunge ble kjøpt fra den koreanske cellelinje bank (Seoul, Korea). NCI-H460 og LL24 normale celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (100 U /ml). A549 og CCD-18Co normale celler ble dyrket i et DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (100 U /ml). Cellekulturer ble deretter holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
celleviabilitet analysen
For å bestemme celle tall, A549 og NCI-H460 lungekreftceller eller CCD- 18Co kolon normal cellelinje og normal cellelinje LL24 lunge ble sådd ut i 24-brønners plater (5 x 10
4 celler /brønn). Subkonfluente celler ble deretter behandlet med thiacremonone (10, 20, og 50 ug /ml) i 72 timer. Etter behandling ble cellene trypsinert og pelletert ved sentrifugering i 5 minutter ved 1500 rpm, resuspendert i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS), og 0,1 ml 0,2% trypan blått ble tilsatt til kreftcellesuspensjon i hver av oppløsningene (0,9 ml hver gang). Deretter ble en dråpe av suspensjonen anbragt i et Neubauer kammer og de levende cancerceller ble opptalt. Celler som viste tegn til farging ble vurdert å være døde, mens de som utelukket trypanblått ble vurdert levedyktig. Hver analysen ble utført i tre eksemplarer.
Transfeksjon
Lung kreftceller (5 × 10
4 celler per brønn) ble sådd ut i 24-brønners plater og transient transfektert med PRDX6 siRNA ( Santa Cruz Biotechnology) eller pcDNA-PRDX6, (generøse gaver fra DR. Jhang Ho Pak, Universitetet i Ulsan College of Medicine ved hjelp av en blanding av Prdx6 siRNA eller pcDNA-Prdx6 og WelFect-EX PLUS reagens i OPTI-MEN, i henhold til produsentens spesifikasjoner (WelGENE, Seoul, Korea).
Luciferase aktivitetsanalyse
A549 og NCI-H460-menneskelige lungekreft celler ble transfektert med prdx6 promoter-Luc plasmid med en blanding av plasmid og WelFect EX PLUS reagens i OPTI-MEN, i henhold til produsentens spesifikasjoner (WelGENE, Seoul, Korea). etter 6 timer ble cellene behandlet med thiacremonone. luciferase aktivitet ble målt ved hjelp av luciferase assay kit (Promega, Wisconsin, USA) i henhold til produsentens instruksjoner (WinGlow, Bad Wildbad, Tyskland)
Western blot analyse
membranen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur med spesifikke antistoffer. kanin polyklonale for PRDX6 og cIAP2 (1 :1,000 fortynning Abcam, plc. Cambridge UK), xIAP, BCL2, caspase-3, caspase-9 (1:1,000 fortynning, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), Bax (1:500 fortynning, Santa Cruz Bioteknologi, Inc.) og monoklonalt for p53, og caspase-8 (1:1,000 fortynning, Cell Signaling Technology, Inc.), p21 (1:500 fortynning, Santa Cruz Bioteknologi, Inc.). Blottet ble deretter inkubert med det tilsvarende konjugert anti-kanin og anti-mus-immunglobulin G-pepperrot peroksydase (1:2,000 fortynning, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Immunreaktive proteiner ble påvist med ECL Western blotting deteksjonssystemet.
glutationperoksidase Activity Assay
GPX ko-substrat blanding, inkludert nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADPH), glutation, og glutation reduktase, ble brukt å måle glutation-peroksydase-aktivitet in vitro. En GPX Assay Kit ble kjøpt fra Cayman Chemical (Michigan, USA) og prosedyrer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Etter behandling av cellene, ble de homogenisert og underkastet analyse, og absorbansen verdien ble målt ved 340 nm og normalisert til proteinkonsentrasjon.
Molekylær modellering
Krystallstrukturen til PRDX6 (PDB kode 1prx) ble anvendt for forankrings studien. Den thiacremonone ble bygget ved hjelp av en Maestro bygge panel. Forbindelsen ble minimert ved hjelp av Impact modul av Maestro i Schrödinger Suite Program. Start koordinere av PRDX6 ble ytterligere modifisert for binding modell prediksjon. Den proteinstruktur ble minimert ved hjelp av Protein Forberedelse veiviseren ved å bruke en OPLS kraftfelt. For gittergenerering, ble bindingssetet er definert som det geometriske tyngdepunkt av den Cys 47 i det katalytiske sete av PRDX6. Ligand docking til den katalytiske stedet av PRDX6 ble utført ved hjelp av Schrödinger docking program, Glide. Den minimert konformasjon av thiacremonone var forankret i forberedt reseptoren rutenettet. De best forankret positurer ble valgt som den første kovalente modell av Cys 47 i den katalytiske stedet av PRDX6 med thiacremonone. De kovalente komplekser ble ytterligere redusert ved bruk av den bratteste nedstigningen algoritmen. Molekylær grafikk for kovalent binding modell av thiacremonone ble generert ved hjelp av en PyMol pakke (https://www.pymol.org).
Pull Down analysen
Thiacremonone ble konjugert med cyanogenbromid ( CNBr)-aktivert Sepharose 4B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). I korte trekk ble thiacremonone (1 mg) oppløst i 1 ml koblingsbuffer (0,1 M NaHCO3 og 0,5 M NaCl, pH 6,0). Den CNBr-aktivert Sepharose 4B ble svellet og vasket i 1 mM HCl gjennom et sintret glassfilter og deretter vasket med koblingsbuffer. CNBr-aktivert Sepharose 4B kuler ble tilsatt til thiacremonone holdige koblingsbuffer og inkubert ved 4 ° C i 24 timer. Den thiacremonone-konjugert Sepharose 4B ble vasket med tre sykluser med vekslende pH-vaskebuffer (buffer 1, 0,1 M acetat og 0,5 M NaCl, pH 4,0; buffer 2, 0,1 M Tris-HCl og 0,5 M NaCl, pH 8,0). Thiacremonone-konjugerte perler ble deretter ekvilibrert med en bindingsbuffer (0,05 M Tris-HCl og 0,15 M NaCl, pH 7,5). Kontroll ukonjugert CNBr-aktivert Sepharose 4B-perler ble fremstilt som beskrevet ovenfor i fravær av thiacremonone. Cellelysatet eller PRDX6 rekombinant protein (Abnova, Taipei, Taiwan) ble blandet med thiacremonone-konjugert Sepharose 4B eller Sepharose 4B ved 4 ° C i 24 timer. Perlene ble deretter vasket tre ganger med TBST. De bundne proteiner ble eluert med SDS ladningsbuffer. Proteinene ble deretter løst ved SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting med antistoffer mot PRDX6 (1:1,000 fortynning Abcam, plc. Cambridge, UK).
Etikk erklæringen
Alle forsøkene ble godkjent og utføres i henhold til guide for omsorg og bruk av dyr [Animal Care komité Chungbuk National University, Korea (CBNUA-436-12-02)].
Animal Experiment
12- uke gammel C57BL /6J-Tg (Prdx6) mus ble kjøpt fra Jackson Lab (Maine, USA) og 12-ukers gamle C57BL /6 mus ble kjøpt fra Koatech (Pyeongtaek, Korea). Musene ble delt i fire grupper. Lewis lungekarsinom (LLC) celler ble injisert subkutant (1,2 × 10
6 tumorceller /0,1 ml PBS /dyr) med en 27 gauge nål. Etter 10 dager, to grupper av mus (n = 10) var i.p. injisert med thiacremonone (30 mg /kg i PBS og 0,01% DMSO) to ganger i uken i 3 uker. Kontrollgruppen av mus (n = 20) ble behandlet med vehikkel [PBS og 0,01% DMSO (i.p.)]) to ganger i uken i 3 uker. For subkutane svulster den maksimalt tillatte størrelsen er 20 mm i diameter for en mus, så vi ofret alle mus før de når maksimal størrelse Livmorhals forvridning ble utført for aktiv dødshjelp.
Immunohistochemistry
Alle vevsprøver ble fikset i formalin og parafin kabin for undersøkelse. §§ 4 mikrometer tykke ble farget med hematoxylin og eosin (H E) og immunhistokjemi. Seksjonene ble så blottet og inkubert med monoklonale antistoffer fra mus og ble vasket tre ganger i 5 minutter hver i PBS, og deretter inkubert med sekundære antistoffer i 2 timer. Etter lysbildene ble vasket og utviklet med DAB, ble platene kontra med hematoksylin, montert i aqua-mount, og evaluert på et lysmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
Data Analysis
dataene ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism 4 ver. 4,03 programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjellene i alle data som ble vurdert ved en-veis analyse av varians (ANOVA). Når P-verdien i ANOVA-testen indikerte statistisk signifikans, ble forskjellene vurdert av Dunnetts test. En verdi på P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Binding mellom thiacremonone og PRDX6
Samspillet ble vurdert i en pull-down analysen bruker thiacremonone-. Sepharose 4B kuler, og etter PRDX6 ble påvist ved immunblotting med anti-PRDX6. Resultatene indikerte at thiacremonone bundet med rekombinant PRDX6 protein eller cellelysater inneholdende PRDX6 proteinet fra humane NCI-H460-lungekreftceller. (Fig. 1 B og C). Å identitet bindingsstedet thiacremonone til PRDX6, vi utført en beregnings docking modell av thiacremonone med PRDX6 under Schrödinger docking program, Glide. Resultatene fra docking studier antydet at thiacremonone kan kovalent binde med Cys 47 rester i PRDX6 katalytiske. Båndet representasjon docking modell av thiacremonone med PRDX6 indikerte at følgende interaksjoner er mulig i det katalytiske sete; sidekjeden av 44 Thr, Met 127 og Val 46 av PRDX6 (fig. 1E). Vi fant også redusert binding av thiacremonone med mutant PRDX6 C47S forhold til PRDX6 (Fig. 1 D). Som vist på fig. 1F, molekylær overflate representasjon av en docking modell der bindingen lomme for thiacremonone er dannet i PRDX6.
Effekt av Thiacremonone på PRDX6-Luciferase aktivitet og uttrykk og aktivitet av PRDX6
For å teste om samhandling mellom thiacremonone og PRDX6 kunne dempe prdx6-mediert promoteraktivitet og ekspresjon, ble cellene behandlet med thiacremonone (10, 20, og 50 ug /ml) i 6 timer i A549 og NCI-H460-humane lungekreftceller transfektert med en prdx6 avhengig luciferase reporter konstruere. Luciferaseaktiviteten av kreftceller transfektert med prdx6 promoter-Luc-plasmid var mer enn 5 * 10
4 RLU /mg protein, og ved behandling med thiacremonone skyldes undertrykkelse av luciferase-aktivitet i kreftceller (Fig. 2A). I samsvar med den hemmende virkning på luciferase-aktivitet, ble ekspresjonen av PRDX6 også redusert med thiacremonone i kreftceller (Fig. 2B). Vi bekreftet ytterligere relativ glutationperoksidase aktivitet ved thiacremonone. Thiacremonone hemmet glutation-peroksydase-aktivitet av både lungekreftceller, 72 timer etter behandling med thiacremonone som vist i fig. 2C. Disse resultater antyder at bindingen av thiacremonone til PRDX6 fører til hemming av PRDX6 ekspresjon og aktivitet.
(A) lungekreftceller ble transfektert med luciferase prdx6-plasmid, og deretter behandlet med thiacremonone i 6 timer. Luciferase-aktivitet ble deretter bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) lungekreftceller ble behandlet med thiacremonone i 72 timer. Celleekstrakter ble analysert ved western blotting. Hvert bilde og bandet er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Nivåene av glutation-peroksydase-aktivitet i lungekreftceller ble målt ved å anvende analysesett, som beskrevet i Materialer og metoder. (D) Cellene ble høstet ved trypsinering og farget med 0,2% trypanblått. Verdier (A, C og D) er gjennomsnitt ± S.D. * P 0,05 sammenlignet med vesentlig forskjellig fra ubehandlede kontrollceller
Effekt av Thiacremonone på cellevekst i en rekke av kreftceller, inkludert lungekreft celler
Siden PRDX6 er innblandet i lunge. kreft celle vekst, undersøkte vi om samspillet mellom thiacremonone og PRDX6 kunne hemme PRDX6 aktivitet, og dermed hemme kreft celle vekst. For å vurdere den inhiberende effekt av thiacremonone på cellevekst av lungekreftceller, A549 og NCI-H460, analyserte vi cellenes levedyktighet ved direkte celle-telling. Cellene ble behandlet med flere konsentrasjoner av thiacremonone (10, 20, 50 ug /ml) i 72 timer. Som vist i figur 2D, thiacremonone inhiberte celleproliferasjon av lungekreftceller på en konsentrasjonsavhengig måte. Sytti-to timers behandling av thiacremonone inhiberte A549 cellevekst med IC
50-verdien av 46 ug /ml, og NCI-H460-celler vekst med IC
50 verdier på 42 ug /ml, henholdsvis. Morfologisk observasjon viste at cellene ble gradvis redusert i størrelse og skiftet til en liten rund enkelt celleform med behandling av thiacremonone i A549-celler og NCI-H460-celler. Vi har bekreftet normal cellevekst-inhibering ved hjelp av CCD-18 tykktarm og lunge LL24 normale celler. Men thiacremonone viste ingen cytotoksisk effekt i normale celler (figur S1).
Effekt av Thiacremonone på celledød ved apoptose og uttrykk for apoptotisk regulatoriske proteiner
Apoptose er prosessen med programmert celledød som har en viktig rolle i anti-kreft-effekter av kjemoterapeutika [18]. For å fastslå at inhibisjon av cellevekst ved thiacremonone skyldes induksjon av celledød ved apoptose, evaluerte vi endringene i kromatin morfologien av celler ved hjelp av DAPI farging etterfulgt av TUNEL-farging analyser. De doble merkede cellene ble deretter analysert ved fluorescens mikroskop. Motsatt med hemming av cellevekst, ble DAPI-farget TUNEL-positive celler betydelig økt i thiacremonone behandlede celler. Behandlingen av thiacremonone resulterte i omtrent 45% og 65% induksjonen av apoptotisk celledød i A549 og NCI-H460-kreftceller, henholdsvis (fig. 3A). Aktiveringen av celledød regulatoriske proteiner inkluderer caspaser-9 og-3, så vel som Bax, fører til apoptose i kreftceller [19]. For å finne ut uttrykket av celledød regulatoriske proteiner ved thiacremonone ble uttrykk for celledød ved apoptose relaterte proteiner undersøkt av Western blot. Uttrykket av pro-apoptotiske proteiner, Bax og spaltet form av caspase-3, -8, -9, og p21 og p53 ble økt med en behandling av thiacremonone. Det ble imidlertid uttrykk for BCL2, xIAP, og cIAP2 redusert med en behandling av thiacremonone (Fig. 3B).
(A) lungekreft celler ble behandlet i fravær (
Venstre paneler
) og nærvær av thiacremonone (50 ug /ml,
høyre pANNELS
) i 72 timer, og deretter merket med DAPI og TUNEL løsning. Totale antall celler i et gitt område ble bestemt ved hjelp av DAPI nukleær farging (fluorescerende mikroskop). Den grønne fargen på de faste celler markerer tunel-merkede celler. For kvantifisering ble tre tilfeldig utvalgte områder vurdert. Den apoptotiske indeksen (%) ble bestemt som (TUNEL-positive celle nummer /totalt DAPI farget celle nummer) x 100 (forstørrelse, 200 ×). Verdier er gjennomsnitt ± S.D. * P 0,05 sammenlignet med vesentlig forskjellig fra ubehandlede kontrollceller. (B) De lungekreftceller ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av thiacremonone (10, 20, og 50 ug /ml) i 72 timer. Ekspresjon av apoptose regulatoriske proteiner ble bestemt ved hjelp av Western blot-analyse. Hvert bilde og bandet er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Reverse av hemmende effekt Thiacremonone på kreft celle vekst ved Transfeksjon av Mutant PRDX6 (C47S)
For å undersøke om cellevekst var hemmet av et samspill av thiacremonone og pRDX6 ble lungekreftceller transfektert med C47S-prdx6. Den hemmende effekten av thiacremonone på kreftcellevekst reverseres ved mutant PRDX6 (C47S), og uttrykk og aktivitet av PRDX6 er også reversert (Fig. 4). Disse resultater antyder at interaksjonen av PRDX6 med thiacremonone kunne ha betydning for lungekreft cellevekst, og thiacremonone undertrykker kreftcellevekst lunge (fig. 4A) via undertrykkelse av PRDX6 ekspresjon (Fig. 4B) og glutation-peroksydase-aktivitet (Fig. 4C) . Videre DTT og GSH trykkes de inhiberende virkninger av thiacremonone på cellevekst, ekspresjon PRDX6 og glutation-peroksydase-aktivitet (Fig. 5). Disse data viste at thiacremonone inhiberte cellevekst via inhibering av glutation-peroksydase-aktivitet og ekspresjon av PRDX6.
(A) lungekreftceller ble transfektert med pcDNA-prdx6 eller pcDNA-prdx6 C47S, og deretter, thiacremonone ble behandlet ( 50 ug /ml) i ytterligere 72 timer. Cellene ble høstet ved trypsinering og farget med 0,2% trypanblått. (B) Celleekstrakter ble analysert ved western blotting. Hvert bilde og bandet er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Nivåene av glutation-peroksydase-aktivitet i lungekreftceller ble målt ved å anvende analysesett, som beskrevet i Materialer og metoder. Verdier er gjennomsnitt ± S.D. #, S 0,05 signifikant forskjellig fra ubehandlede kontrollceller. *, P 0,05, signifikant forskjellig fra ubehandlede kontrollceller transfektert med pcDNA-prdx6 C47S.
, p. 0,05, signifikant forskjellig mellom pcDNA-prdx6 og pcDNA-prdx6 C47S behandlet med thiacremonone
(A) lungekreft celler ble samtidig behandling med angitte konsentrasjoner av DTT ( 10 og 100 nM) eller GSH (100 og 200 uM) med thiacremonone (50 ug /ml) i 72 timer. Cellene ble høstet ved trypsinering og farget med 0,2% trypanblått. (B) Celleekstrakter ble analysert ved western blotting. Hvert bilde og bandet er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Nivåene av glutation-peroksydase-aktivitet i lungekreftceller ble målt ved å anvende analysesett, som beskrevet i Materialer og metoder. Verdier (A og C) er gjennomsnitt ± S.D. #, P 0,05 sammenlignet med vesentlig forskjellig fra ubehandlede celler med thiacremonone. *, P 0,05, signifikant forskjellig fra ubehandlede celler med DTT eller GSH ..
, p. 0,05, signifikant forskjellig mellom behandlet celle med thiacremonone og co-behandlede celler med DTT eller GSH og thiacremonone
Thiacremonone hemmet tumorvekst i vivo allograft
å belyse anti-tumor effekt av thiacremonone in vivo, den tumorvekst i allograft bærende mus følgende thiacremonone behandlinger ble undersøkt. I LLC allograft studiene ble thiacremonone administrert intraperitonealt to ganger per uke i 3 uker til mus. Tumorvolumet ble målt hver uke, og alle musene ble avlivet ved slutten av forsøket når tumorer ble dissekert og veiet. Den inhiberende effekt av thiacremonone på veksten av lungetumor var signifikant i begge allograft-modeller ved hjelp av C57BL /6J-mus så vel som PRDX6 overuttrykkes mus. Den relative tumorvekst ble målt etter behandling av thiacremonone (30 mg /kg, n = 10). Tumorvekst i C57BL /6J (tumor volum; 8000,4 ± 2000,7 mm
3, veie svulst, 4,7 ± 0,82 g) mus ble signifikant redusert med thiacremonone (tumor volum; 4543.6 ± 731.1 mm
3, tumor vekt; 3,45 ± 0,31 g, fig. 6A). Denne hemmende effekten ble funnet i PRDX6 overexpressed mus (tumor volum; 10060,5 ± 1039,6 mm
3 (Tg-kontroll) versus 5048.9 ± 737,9 mm
3 (Tg-thiacremonone), tumor vekt, 4,9 ± 0,21 g (Tg -kontroll) versus 3,44 ± 0,78 g (Tg-thiacremonone), fig. 6B). Den immunhistokjemi analyse av tumor delen av H E, og ved spredning antigener mot PCNA flekker avdekket at thiacremonone hemmet tumorvekst, men vurderinger av pro-apoptotiske proteiner, Bax og kløyvet caspase-3 av IHC avslørt oftere i thiacremonone behandlet LLC bærende C57BL /6J mus og PRDX6 overuttrykt mus (fig. 6C og D).
(A) Tumor volumer, vekter, og bilder av normale mus. (B) Tumor volum, vekt og bilder av PRDX6 overexpressed mus. Verdier (A og B) er gjennomsnitt ± S.D. * P 0,05 signifikant forskjellig fra ubehandlet mus. (C) Tumor deler av normale mus ble analysert ved H E flekken og ekspresjon av proteiner ved immunhistokjemi. De resulterende vev ble utviklet med DAB, og kontra med hematoksylin. (D) Tumor deler av PRDX6 overuttrykt mus ble analysert ved H E flekken og ekspresjon av proteiner ved immunhistokjemi. De resulterende vev ble utviklet med DAB, og kontra med hematoksylin. For kvantifisering, ble 200 celler ved tre tilfeldig utvalgte områder vurdert, og den spesifikke protein positivt fargede celler ble talt opp. Scale bar indikerer 50 mikrometer.
Effekt av Thiacremonone på Expression og aktivitet av PRDX6, og celledød regulatoriske proteiner
For å finne ut av uttrykk for PRDX6 og apoptotisk celledød regulatoriske proteiner ved thiacremonone, uttrykk av proteiner ble undersøkt ved Western blot. PRDX6 ble redusert med behandling av thiacremonone i både normal og PRDX6 overexpressed mus svulstvev. Ekspresjonen av pro-apoptotiske proteiner, Bax og spaltede form av caspase-3, -8, -9, så vel som p21 og p53 ble økt, mens uttrykkene for BCL2, xIAP, og cIAP2 ble redusert ved behandling av thiacremonone i begge normale og PRDX6 overexpressed mus tumorvev (Figur S2A). Som vist i figur S2B, thiacremonone hemmet også glutationperoksidase aktivitet PRDX6 i normal og begge PRDX6 overexpressed mus tumorvev.
Diskusjoner
Mange studier har vist at fersk hvitløk ekstrakter, alderen hvitløk, hvitløk olje og spesifikk organosvovelforbindelser generert ved å prosessere hvitløk kunne forandre karsinogen metabolisme, hemme tumorcellevekst gjennom induksjon av cellesyklus-stans, apoptose, og forebygging av promotering og angiogenese [20] – [21] i en rekke forskjellige kreftcellelinjer, inkludert hepatoma, cervical, prostata, lunge, tykktarm kreft celler [22] – [26]. Diallyl trisulfid (DATS), en sulfane svovelholdig forbindelse viste den sterkeste inhibering av celleproliferasjon og den største induksjon av caspase-3 aktivitet i HepG2 celler [23]. DATS undertrykker human lungekreft cellevekst ved å forårsake G2-M fasen cellesyklus arrest fulgt av Bax-mediert apoptose [26]. Diallyl sulfid (DAS) induserer cellesyklus og apoptose gjennom p53, caspase- og mitokondrier avhengig baner i HeLa menneskelige livmorhalskreftceller [25]. Allicin (diallyl thiosulfinate) induserer apoptose i tykktarmskreftceller [22]. Thiacremonone ble isolert som en sulfurcompound fra en varmtvannsekstrakt av hvitløk, og fant at denne forbindelsen kan ha en anti-kreft effekt på tykktarmskreft [27]. Våre nåværende data viste henholdsvis at en syttito timer behandling av thiacremonone indusert celledød av lungekreftceller med en IC
50-verdien av 46 ug /ml i A549-celler og 42 ug /ml i NCI-H460-celler. Lungekreft cellevekst ble signifikant redusert ved DATS i en treringstrinnet og tidsavhengig måte med en IC
50 3,6 ug /ml [26], og med en IC
50 på 7,3 ug /ml etter dads [34]. IC
50 S-allylcysteine (SAC) til humane metastatiske celler var omtrent 5,3 mg /ml på dag 3 [28]. Etter behandling i 24 timer, cellevekst av prostata kreftceller med 9 ug /ml Sulforafane (SFN) var 10,2 ± 3,1% sammenlignet med den i kontrollcellene (100%) [29]. Selv om konsentrasjoner av forbindelser som fører kreftcellevekst-inhibering er forskjellige, det avhenger av celletype og forbindelser behandles, avledede forbindelser fra hvitløk, inkludert thiacremonone har en anti-kreft effekt. Men eksakte virkningsmekanismer er fortsatt uklart.
Som PRDX6 skatte peroksid, for eksempel små H
2o
2, støtter overlevelse av kreftceller og tumor vedlikehold [30]. Mange studier har vist at PRDX6 fremmer invasjon og metastasering av en rekke forskjellige kreftceller, inkludert lunge-, bryst- og eggstokk-kreft celler [4], [12], [31]. PRDX6 er uttrykt i alle viktige organer, med et spesielt høyt nivå i lungene [32]. Videre PRDX6 ble funnet på et høyere nivå i lunge plateepitelkarsinom pasienter [33]. Overekspresjon av PRDX6 økt lungekreft cellevekst via aktivitet av PRDX6 [4]. Således målretting PRDX6 av visse forbindelser ville være effektive for lungetumorvekst-inhibering som kjemoterapeutika. PRDX6 har to enzymaktiviteter som glutationperoksidase og iPLA2 [32]. Glutationperoksidase fremmer veksten av kreft celler via hemming av apoptose og en høyere sannsynlighet eller tilbakefall blant annet lungemetastaser og lokalt residiv [34]. Glutationperoksidase hemmer cisplatin-indusert apoptose via den nedregulering av BCL2 i NCI-H460-humane lungekreftceller [35].
