Abstract
Bakgrunn
CCN familie, bestående av seks medlemmer (Cyr61, CTGF, Nov, WISP-1, WISP-2, WISP-3), er involvert i stimulering av celleproliferasjon, migrasjon, adhesjon, angiogenese, og tumorigenesis. Flere studier har vist at ekspresjon av Cyr61, CTGF, og WISP-1 påvirker karsinogent potensial for lungecancerceller in vitro. Men sammenhengen uttrykkes i CCN familie proteiner og kliniske trekk ved lungekreft er fortsatt ukjent.
Metodikk og hovedfunnene
I dette arbeidet har vi kvantifisert mRNA nivåer av
Cyr61
,
CTGF
, og
WISP-en
i prøver fra 60 primære lunge kreft og deres matchede normale lunge vev av kvantitativ real-time PCR-analyse. Nedregulering av
Cyr61 Hotell og
CTGF
gener og oppregulering av
WISP-en
genet ble funnet i primære lunge kreft i forhold til de sammenkoblede normale lunge vev. Immunhistokjemi analyser avslørte også en lignende uttrykk mønster av Cyr61, CTGF, og WISP-1 protein i sammenkoblede lungekreft vev. Statistisk analyse viste signifikante assosiasjoner mellom uttrykk for enten
Cyr61
eller
CTGF
med tumorstadium, tumorhistologi, metastase, røyking og slektshistorie ved diagnose. En signifikant korrelasjon også eksisterte mellom WISP-1 uttrykk med tumorhistologi, og pasientens alder. Videre uttrykk nivåer av
Cyr61 Hotell og
CTGF
korrelert med overlevelsen av lunge-kreftpasienter.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at
Cyr61
,
CTGF
, og
WISP-en
kan være innblandet i utvikling og progresjon av primære lunge kreft, og deres nivåer kan tjene som verdifulle prognostiske markører, samt potensielle mål for terapeutisk intervensjon
Citation:. Chen PP, Li WJ, Wang Y, Zhao S, Li DY, Feng LY, et al. (2007) uttrykk for
Cyr61
,
CTGF
, og
WISP-en
korrelerer med kliniske lungekreft. PLoS ONE 2 (6): E534. doi: 10,1371 /journal.pone.0000534
Academic Redaktør: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, USA
mottatt: 16 mars 2007; Godkjent: 24 mai 2007; Publisert: 20 juni 2007
Copyright: © 2007 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation National of China (No. 30370690, 30470847, og 30528003 for Xie, D .; nr 30200143 for Tong, X.), Chinese Academy of Sciences (One Hundred Talenter programmet, Grant KSCX-YW-R -73 for Xie, D.), Science Technology Commission of Shanghai kommune 04DZ14007 og 05DJ14009 (Xie, D.); Kina Postdoktor Science Foundation (Wang, Y.), og Chinese Academy of Sciences K.C. Wong postdoktorstipend (Wang, Y.)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste. årsaken til kreftdød i verden [1]. De fleste av lungekreft er ikke-små-celle lungekreft (NSCLC), som er oppdelt i adenokarsinom (AC), squamous cellekreft (SC), og storcelle karsinom [2]. Den høye dødeligheten forbundet med NSCLC er delvis på grunn av metastaser før kirurgisk fjerning av primærtumor. Tumormetastaser omfatter løsgjøring av tumorceller fra den primære tumormasse, microinvasion av tumorceller inn i stroma vev, intravasation av tumorceller inn i blodårer, og ekstravasering og vekst av tumorceller i sekundærsider [3], [4]. For å bli metastatisk, må kreftceller øker uttrykket av metastase fremme gener og /eller redusere uttrykk for metastase undertrykke gener. Anvendelse av humane lungekreft-cellelinjer, har cysteinrike proteiner 61 (Cyr61) og bindevev vekstfaktor (CTGF) blitt vist å hemme metastase og invasjon av kreft celler, og derfor er blitt betraktet som potensielle suppressorer av metastase [5], . [6]
Både CTGF og Cyr61 tilhører CCN familien, oppkalt etter sine tre første beskrevet medlemmer – Cyr61 (CCN1), CTGF (CCN2), og november (nefroblastom uttrykt, CCN3) [7]. CCN familie har seks medlemmer: Cyr61, CTGF, Nov, WISP-en (Wnt-1-indusert utskilt protein 1) (CCN4), WISP-2 (CCN5) og WISP-3 (CCN6) [8] – [11]. Disse proteinene er modulær struktur, bestående av en N-terminal signalsekvens, etterfulgt av domener med sekvenslikhet til insulin-lignende vekstfaktor-bindingsprotein, von Willebrand faktor C, trombospondin type 1, og en cystein knute ved den C-terminus med en unntak av WISP-2, som mangler den C-terminale region [12]. Alle CCN molekyler utskilles, ekstracellulære matriks-assosierte proteiner og er involvert i interne og eksterne cellulær signalisering for å regulere celle adhesjon, migrasjon, mitogenese, differensiering og overlevelse [13]. De regulerer også angiogenese [13] – [15]. Tidligere studier antydet at Cyr61 induserer celleproliferasjon, celleadhesjon og angiogenese ved aktivering av integrin (αVβ3) i endotelceller [16]. CTGF spiller en nøkkelrolle nedstrøms av TGF-β og SMAD signalering og stimulerer produksjonen av fibronektin og kollagen, som er viktig for sårheling [17], [18]. WISP-1 er sterkt uttrykt i fibrovascular stroma av brystsvulster i Wnt-1 transgene mus [10]. Tvunget overekspresjon av WISP-1 i normale rottenyre-fibroblaster (NRK-49F) var tilstrekkelig til å indusere deres transformasjon [11]. Videre har økende bevis antydet at CCN proteiner som er involvert i tumordannelse, og variasjon av ekspresjon av disse molekylene er blitt observert i flere typer kreft [8], [9].
Vi har vist at Cyr61 handlet som en tumor suppressor i veksten av NSCLC celler. Cyr61 undertrykkes veksten av NSCLC-celler ved å utløse en signaltransduksjonsbane ved oppregulering av p53 [6], [19]. CTGF og WISP-en også påvirket tumorigenitet av lungekreftceller [5], [20] – [22]. Men korrelasjoner mellom de tre molekyler med kliniske tegn på lungekreft er uutforsket. Vår tidligere arbeid foreslo at uttrykket av CCN familie proteiner har prognostisk verdi for glioma progresjon og total pasient overlevelse [23]. I dagens studier, utførte vi real-time kvantitativ RT-PCR og immunhistokjemi å måle mRNA og proteinnivåer tre CCN gener i primær NSCLC prøvene og deres matchede normale lungevev. Videre bestemmes vi om nivåer av disse CCN genene ble korrelert med kliniske NSCLC prøvene av flere statistiske analysemodeller.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Denne studien analysert den primære kreft og matchet normalt vev fra 60 NSCLC pasienter behandlet ved First Affiliated Hospital of Zhengzhou University (Henan, Kina) 2002-2005 etter at skriftlig informert samtykke. Cancer prøver ble resektert kirurgisk uten neo-adjuvant behandling og tilsvarende ikke-cancervev, som var minst 3-4 cm fra kreft, ble også oppnådd. Hver prøve ble delt i 2 deler: en ble seksjonert og undersøkt histologisk av tradisjonelle H den andre ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Vårt arbeid ble godkjent av Institutional Review Board for Institutt for Nutritional Sciences, Chinese Academy of Sciences.
RNA ekstraksjon og cDNA syntese
Total RNA ble ekstrahert fra fersk-frosne NSCLC prøver og matchet normal lunge vev ved TRIzol reagens (Life Technologies, Inc.) i henhold til produsentens protokoll. Kvaliteten på RNA-prøvene ble bestemt ved elektroforese gjennom agarosegeler og farving med etidiumbromid, ble 18S og 28S RNA-bånd visualisert under UV-lys. 2 mikrogram av total RNA ble behandlet direkte til cDNA ved revers transkripsjon med Superscript II (Life Technologies, Inc.) i henhold til produsentens protokoll i et totalvolum på 50 ul.
Sanntids revers transkripsjon PCR (RT -PCR)
RT-PCR ble karakterisert ved et punkt under sykling når amplifikasjon av PCR-produktet først ble oppdaget, snarere enn mengden av PCR-produkt samlet etter et visst antall sykluser. Parameteren Ct ble definert som den fraksjonelle syklus nummeret som fluorescensen som genereres ved å føre en fast terskel over basislinjen. Nivået på målet genet i ukjente prøver ble kvantifisert ved å måle Ct verdi: Level (mål) = 2
Ct (mål). Den Ct verdien av β-
aktin
ble også målt som endogene RNA kontroll: Level (β-
aktin
) = 2
Ct (β
aktin
). Nivåene av målgener i hver prøve ble normalisert på basis av dens β
p-aktin
innhold ved formelen: Normalisert nivå (NL) = Level (target) /nivå (β-
aktin
) = 2
Ct (mål) /2
Ct (β-
aktin
) = 2
Ct (mål) -Ct (β-
aktin
) = 2
ΔCt. Videre ble de relative nivåer (RL) av målgener i cancerprøver versus matchede normale vev beregnet i henhold til formelen: RL = NL (kreft) /NL (normal) = 2
ΔCt (kreft) /2
ΔCt (normal) = 2
[ΔCt (kreft) -ΔCt (normal)] = 2
ΔΔCt. Fordi både NL og RL er representert som to
Ct, vi brukte derfor ΔCt og ΔΔCt som NL og RL, henholdsvis for klinisk statistisk analyse.
Grunning for real-time PCR for
Cyr61
(5′-GAGTGGGTCTGTGACGAGGAT-3 «og 5′-GGTTGTATAGGATGCGAGGCT-3»),
CTGF plakater (5′-CGACTGGAAGACACGT TTGG-3 «og 5′-AGGCTTGGAGATTTTGGGAG-3»),
WISP -1 product: (5′-AGAGCCGC CTCTGCAACTT-3 «og 5′-GGAGAAGCCAAGCCCATCA-3») og β-
aktin plakater (5′-G ATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 «og 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3» ) ble utformet ved hjelp av programvare PRIMER3 og kjøpt fra Shanghai Sangon Biological Engineering Technology Tjenester CO., Ble Ltd Amplification reaksjoner utført i et 20 ul volum av LightCycler-DNA Master SYBR Grønn Ι mix (Roche Diagnostics Ltd, Applied Science, Penzberg, Tyskland) med 10 pmol av hver primer, MgCl
2 konsentrasjonen optimalisert mellom 2 og 5 mM, 200 μΜ av hver dNTP, 0,5 U Taq DNA-polymerase, og 1 x buffer. Alle reaksjoner ble utført i triplikat i et iCycler iQ-system (Bio-Rad, Hercules, CA), og innledende denaturering ved 95 ° C i 3 min ble etterfulgt av 40 sykluser av en denaturering ved 95 ° C i 30 s, et glødetrinn mellom 55 ° C og 58 ° C i 20 s, og et forlengelsestrinn ved 72 ° C i 30 sek. En endelig forlengelsestrinn ved 72 ° C i 7 min ble tilsatt. For å bekrefte spesifisitet forsterkning, ble PCR-produktene fra hver primer par utsatt for et smeltekurve analyse og påfølgende inspeksjon etter agarosegel-elektroforese.
Statistisk analyse
T-test og ANOVA ble vedtatt å studere uttrykket av 60 par av NSCLC og normal lunge vev for hver CCN gen og deres tilknytning til enkelt kliniske faktorer (familiehistorie, metastaser, røyking, tumor stadium, histologi, tuberkulose, kjønn, tumorstørrelse og pasientens alder). Pearsons korrelasjonsanalyse ble brukt til å beregne relative grad av mengden av ekspresjon av de tre gener. Pearsons korrelasjon gjenspeiler graden av lineær sammenheng mellom to variabler. Det spenner 1 til -1. De relative verdier (svulst /kontroll) var i forhold til aktin plottet. For hvert gen, Kaplan-Meier overlevelseskurver for pasienter med høyt genuttrykk
versus
lav genuttrykk ble plottet og log-rank test ble brukt for å sammenligne likestilling mellom de to overlevelseskurver. Multivariabel analyse med Cox-modellen ble brukt til å estimere effektene av de kliniske egenskaper og ekspresjon av de tre gener på overlevelse. Resultatene ble ansett som signifikant ved P 0,05 eller stor betydning ved P 0,01. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av programmet SPSS for Windows (SPSS, Chicago, IL).
Immunohistochemistry
For immunhistokjemi, kreft og tilsvarende normale lungevev ble frosset i en cryostat kammer og 10 mm seksjonene ble samlet på objektglass. Snittene ble fiksert i iskald aceton i 30 minutter, vasket i 0,01 M PBS i 3 x 5 minutter ble blokkert i 1 time i 0,01 M PBS supplert med 0,3% Triton X-100 og 5% normalt serum, og deretter inkubert med kanin anti-human Cyr61 (polyklonale, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), geit anti-human CTGF (polyklonale, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), eller geit anti-humant WISP-1 (polyklonalt, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), henholdsvis, ved 4 ° C over natten. Etter korte vaskinger i 0,01 M PBS ble snittene inkubert i 2 timer i 0,01 M PBS med pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-IgG eller kanin-anti-geite-IgG (1:1000; Chemicon, Temecula, CA, USA), etterfulgt av visualiseringen med 0,003% H
2o
2 og 0,03% DAB i 0,05 M Tris-HCl (pH 7,6). Negative kontrollprøver besto av substitusjon av det primære antistoff med normalt serum ved den samme fortynning. Immunhistokjemi for hvert individ ble utført minst 3 ganger og alle deler ble motfarget med hematoksylin. Scoring av immunhistokjemi farging ble utført uavhengig av tre patolog blindet for pasientens kliniske parametre. Alle farget seksjonene ble scoret både i svulsten og tilstøtende ikke-tumorområder i alle fall i 10 høyeffekts feltet områder med et minimum av 300 bevarte celler vurdert i hvert område. Prosentdelen av celler som uttrykker målproteinet ble beregnet ved å dividere antall positive celler ved det totale antall celler pr høyeffekts feltområdet. Lunge epiteliale celler som bærer tydelig brun signal i cytoplasma, sammenlignet med negativ kontroll ble definert som positive celler. Sammenkoblede-samples t-test ble anvendt for å evaluere forskjellen mellom proteinnivåer Cyr61, CTGF, eller WISP-1 i kreftprøvene sammenlignet med matchede normale lungevev. Resultatene ble vurdert som statistisk meget signifikant ved P 0,01. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av programmet SPSS for Windows (SPSS, Chicago, IL).
Resultater
Uttrykk for
Cyr61
,
CTGF
, og
WISP-1
gener i NSCLC og matchet normale lungevev
for å studere uttrykk mønster av CCN gener i NSCLC, nivåer av
Cyr61
,
CTGF
og
WISP-en
mRNA ble kvantifisert i 60 par av svulster og deres matchet normal lunge vev ved real-time PCR. Expression nivået ble vist som et forhold mellom
Cyr61
,
CTGF
, eller
WISP-1 Hotell og referansen genet β-
aktin
å korrigere for variasjonen i mengden av RNA. Nedregulering av
Cyr61 Hotell og
CTGF
mRNA skjedde i 48 av 60 (80%) og 39 av 60 (65%) NSCLC prøvene sammenlignet med de sammenkoblede normale lunge vev, henholdsvis. I motsetning til oppregulering av nivåer av
WISP-1
mRNA ble observert hos 50 av 60 (83%) NSCLC-prøvene sammenlignet med deres normale vev (Fig. 1). Univariat analyse viste at mRNA nivået av enten
Cyr61
,
CTGF
, eller
WISP-1
gener var signifikant forskjellig mellom kreftprøver og sammenkoblede normale (tabell 1) . Uttrykk for
Cyr61 Hotell og
CTGF
i grunnskolen lungekrefttilfellene var betydelig lavere enn i matchet normal lunge vev (P 0,001 og p = 0,016, henholdsvis). I kontrast, nivåer av
WISP-en
i kreft var betydelig høyere enn i de samsvar normale (P 0,001) (tab 1). Pearsons korrelasjonsanalyse viste at uttrykk for videre
Cyr61 Hotell og
CTGF
ble svært positivt korrelert (R = 0,604, P 0,001), mens uttrykk for
WISP-1 Hotell og
CTGF
viste en signifikant negativ sammenheng (R = -0,299, p = 0,020). Uttrykk for
WISP-1 Hotell og
Cyr61
var ikke signifikant korrelert (R = -0,182, p = 0,164) (tabell 2). Fordi de tre genene er alle medlemmer av CCN familie, er det mulig at deres uttrykk kan bli kontrollert av noen vanlige regulatorer (for
Cyr61 Hotell og
CTGF
) eller motvirket av hverandre (for
WISP-1 Hotell og
CTGF
).
Relative mRNA uttrykk nivåer av
Cyr61
,
CTGF
, og
WISP -1
er vist i 60 par av primære NSCLC vev og matchet normale lungeprøver. Expression vises som et forhold mellom uttrykk for CCN gener i kreft
versus
matchet normalt vev. Hver søyle er log2 verdien av forholdet mellom CCN ekspresjonsnivåer mellom lungesvulster (T) og passet normale vev (N) fra de samme pasientene. Mindre enn to ganger endring: forholdet mellom tumor og normalt er mindre enn 2. Fordi log2 2 = 1, bar verdi 1 representerer 2-dobling (T N), mens bar verdi -1 representerer 2 ganger reduksjon (T N).
Immunohistochemistry ble brukt til å overvåke protein uttrykk for Cyr61, CTGF, og WISP-en på 60 parene av lunge vev. Sammenkoblede-samples t-test viste at protein uttrykk for Cyr61 (P 0,001) og CTGF (P 0,001) ble dramatisk nedregulert i kreftvev sammenlignet med sine vanlige kolleger (figur 2). I tillegg ble betydelig oppregulering av WISP-1 funnet i kreft prøvene (P 0,001) sammenlignet med matchede normale vev (figur 2). Representative fotografier viste at Cyr61 ble sterkt uttrykt i cytoplasma av lunge epitelceller i normal lunge vev hos pasienter med lunge-karsinom (fig. 3A), men nivåene var bemerkelsesverdig redusert i kreft motstykker (Fig. 3B). Spesielt, er den nedregulering av Cyr61 hovedsakelig på grunn av den store reduksjon av Cyr61 ekspresjonsnivået i individuelle celler i stedet for et redusert antall Cyr61-positive lunge epitelceller. CTGF viste høyere intensitet av farging i cytoplasma av normale lunge epitelceller (figur 3D.) Enn det i lungecancerceller (figur 3E.); forholdet mellom CTGF-positive til -negative cellene i kreftvev var klart lavere sammenlignet med de tilsvarende normale lungevev. Selv om ekspresjon av WISP-1 var lav i cytoplasma av epitel-celler avledet fra normale lunge vev (Fig. 3G), ble det merkbart øket i passet lunge-kreft-vev (fig. 3 H). Tatt sammen, resultatet av immunhistokjemi parallell de av real-time RT-PCR.
Grafen viser fordelinger av prøver i henhold til prosentandelen av celler positivt for Cyr61, CTGF, og WISP-en i 60 par av NSCLC og samsvarte ikke-kreft lungevev. P-verdier (sammenkoblede-samples t-test) er oppført som tyder forskjellen mellom NSCLC prøvene versus matchet normalt vev.
I ikke-cancerous lunge vev fra pasienter med NSCLC, intens Cyr61 immunoreaktivitets (brun) er observert i cytoplasma av celler, så vel som det ekstracellulære rom (A). I tilsvarende NSCLC-vev, er Cyr61 immunreaktivitet mindre (B) sammenlignet med normalt lungevev. I likhet med Cyr61, mange CTGF-positive celler (brun) er synlige i ikke-tumor lungevev (D), og positive signaler er bare spredt fordelt i NSCLC-vev (E). WISP-1 immunhistokjemi, men viser et annet uttrykk mønster. WISP-1-immunoreaktivitet (brun) blir knapt påvises i normalt lungevev fra NSCLC (G), men er markert økt i NSCLC vev (H). C, F og I er negative kontroller av Cyr61, CTGF, og WISP-1, respektivt. Alle lysbildene er kontra med hematoksylin (blå). Scale bar = 60 mikrometer.
Forholdet mellom uttrykk for Cyr61 i lungekrefttilfellene og de kliniske og patologiske trekk ved individene
Univariat analyse viste at en signifikant sammenheng eksisterte mellom uttrykk for
Cyr61 versus
tumor stadium, metastase, histologisk subtype, røyking og slektshistorie (tabell 3). Nivå av
Cyr61
uttrykk ble redusert betraktelig i høye scene svulster i forhold til lave scene svulster (p = 0,014). Multiple sammenligning (LSD t-test) analyse viste at uttrykk for
Cyr61
mellom svulster i stadium I og III var signifikant forskjellig (P = 0,004); men ingen signifikant forskjell i
Cyr61
ekspresjonen skjedde i NSCLC-prøvene sammenlikne enten trinn I og II (P = 0,063) eller trinnene II og III (P = 0,17). Histologisk analyse viste at en betydelig forskjell fantes blant SC, AC, adeno-plateepitelkarsinom (ASC) og andre patologiske type i nivået av uttrykk for
Cyr61 product: (P = 0,001). Videre, multippel sammenligning (LSD t-test) viste at uttrykk for
Cyr61
mellom SC
versus
ASC (P = 0,009) eller SC
versus
annen patologisk type (P = 0,001) var signifikant forskjellig. Tilsvarende signifikante forskjeller av
Cyr61
uttrykk ble også observert mellom AC
versus
ASC (P = 0,015) eller AC
versus
annen patologisk type (P = 0,002). Røyking var forbundet med lav uttrykk for
Cyr61 product: (P = 0,009). I kontrast, uttrykk for
Cyr61
var ikke korrelert med tuberkulose, kjønn, alder og tumorstørrelse (tabell 3).
Forholdet mellom uttrykk for
CTGF
i lungekrefttilfellene og de kliniske og patologiske trekk ved individene
Statistisk analyse viste at uttrykk for
CTGF
var sterkt assosiert med noen kliniske trekk ved NSCLC, inkludert tumorstadium, metastase, histologi, røyking og slektshistorie (tabell 3). Nivå av
CTGF
ble redusert betydelig i high-trinns svulster sammenlignet med lav-trinns svulster (p = 0,040). Videre signifikant forskjell på
CTGF
uttrykk eksisterte mellom svulster, stadium I
versus
stadium III (P = 0,013) og stadium II
versus
stadium III (P = 0,024) ; ble imidlertid observert noen signifikant statistisk forskjell mellom svulster, stadium I og II (P = 0,077). For metastaser, uttrykk for
CTGF
i metastatisk NSCLC var betydelig lavere enn i ikke-metastatisk NSCLC (P = 0,039); betydelig, røyking var assosiert med en fremtredende undertrykkelse av
CTGF
uttrykk i NSCLC (P = 0,017) (tabell 3). I tillegg skjedde det en betydelig forskjell mellom SC, AC, ASC og andre patologiske typer i nivået av CTGF (P = 0,005). I tillegg nivå
CTGF
hos pasientene var betydelig lavere enn de som familiemedlemmer hadde ikke kreft (P = 0,038). Men kjønn, tumor størrelse, alder og histologi av tuberkulose viste ingen signifikante sammenhenger med uttrykk for
CTGF product: (Tabell 3).
Forholdet mellom uttrykk for
WISP-en
i NSCLC og de kliniske og patologiske trekk ved individene
Statistisk analyse viste at uttrykk for
WISP-en
var signifikant assosiert med tumorhistologi, samt alder av NSCLC pasienter ved diagnose ( tabell 3). Enveis ANOVA analyse viste at betydelige forskjeller fantes blant SC, AC, ASC og annen histologisk type i deres uttrykk for
WISP-en product: (P = 0,017). Nivå av
WISP-1
i ASC var mye høyere enn i enten SC (P = 0,002) eller AC (P = 0,015). Videre yngre pasienter (alder, 35-50) hadde en betydelig høyere nivå av
WISP-en
i sine svulster enn eldre individer (alder, 50-65 eller ≥65) (P = 0,018 og p = 0,036 , henholdsvis). Derimot ble andre kliniske parametre (familiens historie, metastaser, røykehistorie, tuberkulose, kjønn, tumortype og tumorstørrelse) ikke forbundet med uttrykk av
WISP-en
.
Expression av
Cyr61
,
CTGF
,
WISP-1
gener og klinisk utfall av NSCLC
Univariat overlevelsesanalyse viste at uttrykket av
Cyr61
,
CTGF
, metastaser, og røyking var signifikant assosiert med overlevelse (tabell 4). Kaplan-Meier-kurver antydet at pasienter med høy ekspresjon av
Cyr61
viste en betydelig utvidet midlere overlevelsestid sammenlignet med de andre pasienter (fig. 4A) (P = 0.001). Tilsvarende høye nivåer av
CTGF
var forbundet med lengre overlevelse (Fig. 4B) (P = 0.031). I kontrast, ingen signifikant sammenheng med
WISP-en
uttrykk og overlevelse ble observert (fig. 4C) (P = 0,214). Etter å kontrollere de kliniske og patologiske egenskaper (alder, kjønn, metastaser, røyk, tumor stadium, tuberkulose, tumorstørrelse), ble multivariat (Cox regresjon) overlevelsesanalyse utført for å evaluere de potensielle effektene av de tre CCN gener på kreft prognose. Resultatet viste at både
Cyr61 Hotell og
CTGF
var betydelig uavhengige positive prognostiske faktorer for overlevelse av pasienter med NSCLC, og den relative risikoen var 0,047 for
Cyr61 Hotell og 0,0357 for
CTGF plakater (tabell 5). Men oppsto ingen signifikant sammenheng mellom
WISP-en
uttrykk og overlevelse (tabell 5).
Diskusjoner
Cyr61, CTGF, og WISP-en spiller viktige roller i celleproliferasjon, migrasjon og differensiering. Deres ekspresjon synes å være regulert på en annen måte i forskjellige typer tumorer. Å utforske sammenhengen mellom uttrykk for CCN gener og NSCLC, brukte vi real-time PCR og immunhistokjemi å vurdere mRNA og protein nivåer av disse tre genene i NSCLC og deres matchede normale lungevev. Nedregulering av
Cyr61 Hotell og
CTGF Hotell og oppregulering av WISP-en skjedde i NSCLC prøvene i forhold til sine normale kolleger, noe som tyder på at disse molekylene kan være assosiert med tumordannelse og progresjon i NSCLC.
Cyr61 er den første klonet medlem av familien CCN og dets regulatoriske roller i tumorceller har blitt mye rapportert i mange typer kreft. I brystkreft, er Cyr61 uttrykt og kan stimulere tumorprogresjon [24] – [27]. En gastrisk adenokarsinom cellelinje ble mer tumorigent når cellene ble genmodifisert til å uttrykke høye nivåer av Cyr61 [16]. Uttrykk for Cyr61 var høy i rhabdomyosarcomas og cellelinjer avledet fra maligne melanomer, kolon adenokarsinomer og blære papillomer [16], [28]. Maligne gliomer har ofte høye nivåer av Cyr61 forbundet forbedret tumorgenisitet mediert gjennom integrin-bundne kinase signalveien [29]. Oppregulering av Cyr61 uttrykk ble nylig identifisert i peritoneal metastaser fra menneskelig kreft i bukspyttkjertelen [30]. Paradoksalt nok, synes Cyr61 å ha motsatt rolle i lungekreft. Vi har rapportert at Cyr61 ble nedregulert i fire av 5 prøver av lungekreft, og lungekreft celler stabilt transfektert med en Cyr61 ekspresjonsvektor var mindre tumorigent enn vektoren alene transfekterte kontrollceller [19]. Våre videre studier viste at tvangs ekspresjon av Cyr61 i lungekreftceller resulterte i deres cellesyklusarrest i G1 fase mediert av p53 [6]. Her fant vi at uttrykk for
Cyr61
er redusert hos NSCLC prøvene i forhold til sine matchede kontroller, som sterkt støtter vår tidligere hypotese. Cyr61 ble også rapportert å hemme veksten av prostata kreft [31], livmorkreft [32] og leiomyomas [33]. Til sammen viser resultatene at det Cyr61 kan oppføre seg som en svulst suppressor under visse omstendigheter i flere vevstyper, inkludert NSCLC.
CTGF ble identifisert som en mitogen funnet i kondisjonerte mediet av menneskelige umbilical vein endotelceller [34 ]. Det koder for et protein av 349 aminosyrer med 43% sekvensidentitet med Cyr61, og alle 38 cysteiner i CTGF og Cyr61 er fullstendig bevart. CTGF ble funnet å være overuttrykt i brysttumorer [26], [35], [36] melanomer, pankreas-kreft [37], sarkomer, inkludert chondrosarcomas [38], [39]; mens en invers korrelasjon er blitt rapportert mellom den maligne fenotype og nivået av CTGF ekspresjon i fibroblaster og endotelceller celle svulster [40]. I våre forsøk, fant vi at nivået av uttrykk for
CTGF
i NSCLCs var lavere enn i de matchet normale lungeprøver, noe som tyder på dens potensial tumor-undertrykke funksjon. I samsvar med våre funn, en fersk undersøkelse utført av Chien
et al.
[20] viste at CTGF trykt lungekreft cellevekst ved induksjon av p53, samt ved hemming av insulin-like growth factor-I avhengig Akt fosforylering og epidermal vekstfaktor-avhengige ekstracellulære signalregulerte kinase 1/2 fosforylering.
på den annen side, fant vi at
WISP-en
ble overuttrykt i NSCLC prøvene i forhold til sin normale lungevev kolleger, noe som tyder på at WISP-en kan fungere som et oncoprotein i NSCLC. WISP-1 ble identifisert som et gen som ble oppregulert i Wnt-1 transformerte C57 MG musebryst epitelceller; den har fullstendig konservering av alle 38 cysteinrester med de av Cyr61 og CTGF [10]. WISP-1 har vært forbundet med enten forsterke eller inhibere vekst av tumorer. For eksempel, er det sterkt uttrykt i menneskelig bryst og tykktarm kreft [10]. Tvunget overekspresjon av WISP-1 i normale rottenyre-fibroblaster (NRK-49F) var tilstrekkelig til å indusere deres transformasjon [11]. I motsetning til dette ble WISP-1-ekspresjonen omvendt korrelert med spredning, metastase og vekst av melanomceller [41], [42]. I tillegg vår resultat at oppregulering av WISP-1 positivt korrelert med lungekreft metastaser var i overensstemmelse med resultatene fra en musemodell [21]. Paradoksalt Snart
et al.
Funnet at
in vitro
overekspresjon av WISP-en redusert bevegelighet hos lungekreftceller [22]. Siden WISP-en er et utskilt protein og fungerer i hovedsak ved interaksjon med ECM, kan forskjellen i funnene gjenspeiler forskjellen i ECM
in vivo Hotell og
in vitro
.
univariate statistiske analysen avslørt videre at lave nivåer av enten
Cyr61
eller
CTGF
var relatert med progresjon av NSCLC, og nedregulering av
Cyr61 Hotell og
CTGF
var mer merkbar hos pasienter med familiens historie enn de uten familie historie. Disse data antydet at Cyr61 og CTGF kan være tumorsuppressorgener i lungekreft. Gjennom multippel lineær regresjonsanalyse, dessuten har vi funnet at kliniske funksjoner er nært knyttet til nivåer av uttrykk for
Cyr61
,
CTGF Hotell og
WISP-en
. Expression nivå av
Cyr61
i 71% lungekreft prøvene ble bestemt av åtte uavhengige variabler, hovedsakelig ved AC, SC og alder. Nivåer av
CTGF
i NSCLCs ble også markert i forbindelse med kliniske funksjoner, men med noen forskjeller. Kjønn syntes å spille en rolle i uttrykket av
CTGF
, men ikke
Cyr61
.
