Abstract
Bakgrunn
terpinen-4-ol, er en naturlig forekommende monoterpene hoved bioaktive komponent av tea-tree olje og har vist seg å ha mange biologiske aktiviteter.
Sikt
for å studere antitumor effekter av terpinen-4-ol og virkningsmekanismen i prostata og GI maligniteter , alene og i kombinasjon med kjemoterapeutika og biologiske midler.
Metoder
terpinen-4-ol ble administrert alene eller i kombinasjon med standard kjemoterapi (oksaliplatin, Fluorouracil, gemcitabin, Tarceva) og biologisk middel ( cetuximab). Det ble også kombinert med humanisert anti-CD24 mAbs (ble utviklet av oss). Killing effekter ble målt kvalitativt ved lysmikroskopi og kvantitativt ved hjelp av MTT og FACS analyse, etter behandling av colorectal, bukspyttkjertel, mage og prostata kreft celler. Terpinen-4-ol effekt på tumorutvikling ble undersøkt i xenograft modell.
Resultatene
terpinen-4-ol induserer en betydelig vekst inhibering av tykktarms, bukspyttkjertel, prostata og magekreftceller i en doseavhengig måte (10-90% i 0,005 til 0,1%). Terpinen-4-ol og forskjellige anti-kreftmidler (0,2 uM oksaliplatin og 0,5 pm fluorouracil) demonstrert en synergistisk inhiberende virkning (83% og 91%, henholdsvis) på kreftcelle proliferasjon. I
KRAS
muterte kolorektal kreft celler, som er resistente mot anti-EGFR terapi, som kombinerer av terpinen-4-ol med cetuximab (1 mikrometer) resulterte i imponerende effekt på 80-90% veksthemming. Sub-toksiske konsentrasjoner av terpinen-4-ol potensiere anti-CD24 mAb (150μg /ml) indusert veksthemming (90%). Betydelig reduksjon i tumorvolum ble observert etter terpinen-4-ol (0,2%) behandling alene og med cetuximab (10mg /kg) (40% og 63%, henholdsvis) som sammenlignet med kontrollgruppen.
Konklusjon
terpinen-4-ol forsterker effekten av flere kjemoterapeutiske og biologiske midler i betydelig grad. Den mulige molekylære mekanisme for sin aktivitet involverer induksjon av celle-død gjengivelse av denne forbindelse som et potensielt anti-kreft legemiddel alene og i kombinasjon ved behandling av en rekke kreftformer. Terpinen-4-ol gjenoppretter aktiviteten av cetuximab i kreft med mutert KRAS
Citation. Shapira S, Pleban S, Kazanov D, Tirosh P, Arber N (2016) terpinen-4-ol: A Novel og lovende terapeutisk middel for menneskelig Gastrointestinale kreft. PLoS ONE 11 (6): e0156540. doi: 10,1371 /journal.pone.0156540
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 26 februar 2016; Godkjent: 16 mai 2016; Publisert: 08.06.2016
Copyright: © 2016 Shapira et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. EMERALD BIO-LABS LTD gitt støtte i form av lønn for forfattere SP PT, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser: EMERALD BIO-LABS LTD gitt støtte i form av lønn for forfattere SP . PT, men dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Forkortelser. CRC, tykktarmskreft; DMSO, dimetylsulfoksid; EGFR, epidermal vekstfaktor-reseptor; FACS, fluorescens-aktivert cellesortering; Luc, luciferase
Innledning
Eteriske oljer og deres komponenter hentet fra vegetabilske materialer har blitt funnet å vise antimikrobiell, anti-virus, anti-fungal, anti-oksidanter, anti-inflammatorisk og anti-kreft-aktivitet [1-3].
Monoterpener er store plante-avledet sekundære metabolitter allment finnes i naturlige produkter, inkludert frukt, grønnsaker og urter og kjent for å være forbundet med anlegget forsvarsmekanismer. De monoterpener består av to isopren enheter, og finnes i store mengder i eteriske oljer [4,5]. I tillegg har mange monoterpener vært foreslått å utøve potent antikreft-aktivitet. Noen av dem vises velig lovende resultater i forebygging og behandling av forskjellige typer leukemi og kreft, for eksempel bryst, hud, bukspyttkjertel og kolon kreft hos gnagere [6]. Spesielt, flere av disse forbindelser, blant dem Perillyl alkohol og limonen, blir testing i de pågående studier på mennesker [7-9].
terpinen-4-ol, en av de viktigste aktive bestanddeler av de tea tree olje består av en blanding av mer enn 100 ulike forbindelser, og finnes i en rekke aromatiske planter (appelsiner, mandariner, Origanum, New Zealand lemonwood treet, japansk cedarand sort pepper) [10]. Terpinen-4-ol er en potent bakteriedrepende middel [11] som har soppdrepende egenskaper [12]. Av spesiell interesse er det
in vitro
aktivitet mot
Staphylococcus aureus Hotell og
C
.
albicans product: [13,14]. Det ble vist at det å kombinere dette naturlige stoffet og konvensjonelle legemidler kan bidra til å behandle motstandsdyktig gjær og bakterielle infeksjoner.
Flere nyere rapporter har antydet at terpinen-4-ol induserer antitumoreffekter ved selektivt å forårsake nekrotisk celledød og cellesyklus arrest i melanomcellelinjer, eller ved å utløse caspase-avhengig apoptose i humane melanomceller, spesielt i medikament (Adriamycin)-resistente celler [15,16]. Videre ble terpinen-4-ol vist seg å lokke fram en doseavhengig cytotoksisk respons på menneskelige ikke-småcellet lungekreft celler, antagelig gjennom involvering av mitokondrie apoptotiske sti [17].
CD24 er en liten , tungt glykosylert mucin-lignende celleoverflateprotein forankret til membranen via glykosyl fosfatidylinositol (GPI) [18]. CD24 er kjent for å være overuttrykt i forskjellige humane kreftformer, både faststoff og hematologisk [19], og er vanligvis bundet med en mer aggressiv forløpet av sykdommen [18,20,21]. Vi har vist at anti-CD24-cancer immunoterapi har potensiell klinisk anvendelse i faste tumorer [21-23]. Derfor ble en kombinasjon av terpinen-4-ol sammen med anti-CD24 behandling undersøkt i dette arbeid.
I denne studien vi forsøkte å vise effekten av anticancer terpinen-4-ol i forskjellige typer av cancer celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Det er også vist at terpinen-4-ol kan gjenopprette styrken av cetuximab i svulster med en mutant RAS.
Materialer og metoder
Material
Alle reagenser ble kjøpt fra Sigma, Israel med mindre annet er angitt. Cellekulturmedier og tilsetningsstoffer ble oppnådd fra Beit-HaEmek, Israel. Annexin V og propidiumjodid- ble kjøpt fra Biotium
Følgende materialer ble testet.
Terpinene-4-ol
Blanding 1 = γ-terpinen, α-terpinen, 1,8-cineole, p-cymene, terpinen-4-ol
Blanding 2 = γ-terpinen, α-terpinen, 1,8-cineole, p-cymene,
forholdet mellom hver forbindelse er beskrevet i Tabell 1.
følgende cytostatika og antistoffer ble testet:
ElOXATIN
® (oksaliplatin) på et konsentrasjoner som varierte mellom 0,2 -0,5 mikrometer
5-FU (Fluorouracil) -.. 0,3-0,5 mikrometer
Gemzar (gemcitabin) – 0,1-1 mikrometer
Tarceva (0,05-0,1 mm) .
erbitux (Cetuximab) ved et konsentrasjonsområde på 1 pM.
humanisert anti-CD24 mAb (humanisert IgG1 antistoff som binder til celleoverflate CD24 protein) i konsentrasjoner på 75 til 150 ug /ml.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Menneske CRC (HT29, HCT116, COLO320), gastrisk karsinom (AGS), bukspyttkjertel (COLO357, Panc-1, MIA-PACA) cellelinjer ble dyrket i høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 5% varme-inaktivert (HI) føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og streptomycin /penicillin. En androgen-uavhengig prostata (DU145, CL-1), og kolorektal DLD1 kreftceller ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 5% HI-FBS.
MTT cellenes levedyktighet assay
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (1×10
4 celler /brønn) i fullstendig medium. På den følgende dag, ble forskjellige konsentrasjoner av de ovenfor beskrevne midler tilsatt til cellene i triplikater. Ved 72 timer senere ble mediet erstattet med friskt medium (100 ul per brønn) inneholdende 1 mg /ml 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) og inkubert i 2 -4 timer. MTT-formazan-krystaller ble oppløst ved tilsetning av 100 ul utvinning buffer. Absorbans ved 570 nm og en referansebølgelengde på 690nm ble registrert på en automatisert mikroplateavleser. Det relative antall levedyktige celler ble sammenlignet med ubehandlede celler.
Transfeksjon og luciferase-assay
transfeksjoner ble utført ved anvendelse av jetPEI
™ (Polyplus-transfeksjon Inc, NY, USA) ifølge produsentens instruksjoner. 5 x 10
5HCT116 celler ble sådd i 6-brønns plater til Luc-analyser. Den neste dag, når cellene var ca 50% konfluent, co-transfeksjon med 3 ug Py4-SV40-LUC vektoren pluss 0,3 ng av PRL-CMV (Promega) ble utført. 24 timer etter transfeksjon ble mediet erstattet og cellene ble utsatt for cetuximab, forskjellig konsentrasjon av terpinen-4-ol eller ubehandlet. Luc-analysen ble utført 48 timer etter etter behandlingen. I korthet ble cellene vasket en gang med PBS og deretter lysert i 250 ~ pl lysebuffer i 5 minutter ved romtemperatur. Lysatene ble sentrifugert ved 14000 rpm i 5 min, og 20 ul av hvert lysat ble anvendt for å måle Luc reportergenekspresjon. Den Luc aktiviteten ble normalisert til Renilla Luc aktivitet fra en parallell co-transfeksjon av PRL-CMVDual Luc system, Promega).
Påvisning av celledød
Celler ble sådd i 12-brønners plater ( 1×10
5-celler /brønn) i komplett medium og behandlet med terpinen-4-ol ved flere konsentrasjoner i 72 timer. Annexin V ble oppdaget i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble vasket med PBS og deretter inkubert i en oppløsning av den membran ugjennomtrengelig atom fargestoff propidiumjodid. Cellene ble deretter umiddelbart analysert ved flowcytometri [FACSCalibur (Becton Dickinson, California)], og resultatene ble analysert ved Cellquest program (Becton Dickinson).
xenograft modell for måling
in vivo
anti-tumor aktivitet av terpinen-4-ol alene og i kombinasjon med biologiske midler
Herre atymiske hårløse mus, 6-8 uker gamle, (Harlan Laboratories) ble plassert i sterile bur og håndteres med aseptiske forholdsregler. De ble foret ad libitum. For å teste det terapeutiske potensialet av terpinen-4-ol, ble eksponensielt voksende kreftceller høstet og resuspendert ved en sluttkonsentrasjon på 5×10
6 celler per 0,1 ml PBS pr injeksjon. Cellene ble injisert subkutant i flanken av musene. Når tumorene var følbar (~ 0,3 cm
3), ble musene tilfeldig delt i grupper og behandlingen ble startet (intraperitoneal og /eller intratumorale injeksjoner). Dyrene ble behandlet to ganger i uken i 3 uker. De ble veiet og tumorvolum ble målt med en passer og plottet etter 3 dager med start fra starten av behandlingen. Tumor volum ble beregnet som 4 /3π ∙ en ∙ b
2. Ved slutten av forsøket ble musene bedøvet og avlivet ved halshugging og svulstene ble skåret ut.
statistikker
Data fra
in vitro
studier er presentert som middelverdi ± SD av settene med data som bestemmes in triplo. Statistisk signifikans mellom behandlingene ble bestemt av t-test, og
P
verdier 0,05 ble betraktet som signifikant. I
i
vivo studier, tumorbærende mus ble randomisert til 5 behandlingsgrupper og tumorvolum ble periodisk overvåket og beregnet som 4 /3π ∙ en ∙ b
2. Signifikante forskjeller mellom grupper og på ulike tidspunkt ble bestemt ved t-test.
Study godkjenning
Studiet ble godkjent av den institusjonelle komité for dyrevelferd ved Tel-Aviv Sourasky Medical Center.
Resultater
Identifikasjon av terpinen-4-ol som effektiv ingrediens
To blandinger med forskjellige monoterpens sammensetning ble testet (tabell 1). Blanding 1 var signifikant mer effektiv og toksisk enn blanding 2 (
P . 0
005
). Den største forskjellen mellom de to ble terpinen-4-ol. Resultatene (figur 1A) indisert for signifikante forskjeller i celleoverlevelse mellom blandinger, slik at vi kan identifisere terpinen-4-ol og dens bidrag til den cytotoksiske effekten.
A. Identifikasjon og isolering av terpinen-4-ol. To blandinger (deres sammensetning er beskrevet i tabell 1) av monoterpens ble testet på kolorektal (HCT116, DLD1, COLO320), mage (AGS), bukspyttkjertel (PANC-en, COLO357, MIA-PACA) og prostata (CL-1, DU145 ) kreft cellelinjer. 1×10
4 celler ble sådd i 96-brønns plater i fullstendig medium. 0,05% av blandingene ble tilsatt til cellene på den neste dag. Celleoverlevelse ble bedømt ved hjelp av enzymatisk MTT assay72 timer etter behandlingen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. *
P
.
05
, **
P
.
005
. B. terpinen-4-ol-aktivitet ikke er avhengig av nærvær av DMSO. 1×10
4CRC, mage, bukspyttkjertel og prostata kreft celler ble sådd ut i 96-brønners plater i fullstendig medium.0.05% av terpinen-4-ol med eller uten 0,01% DMSO ble tilsatt til cellene på den neste dag. Celleoverlevelse ble bedømt ved hjelp av enzymatisk MTT assay72 timer etter behandlingen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. *
P
.
05
, **
P
.
005
.
Ingen effekt av DMSO på aktiviteten av terpinen-4-ol
En av de hindringene som oppstår når du bruker cytotoksiske forbindelser som terapeutisk midler er deres lave oppløselighet i farmasøytiske løsninger og deres lave evne til å trenge inn i cellene. I den grad, undersøkte vi hvorvidt terpinen-4-ol vil være aktiv i fravær av dimetylsulfoksid (DMSO). DMSO ble benyttet for å oppløse terpinen-4-ol og dets virkning ble evaluert. Det fremkom at den cytotoksiske aktivitet av terpinen-4-ol ble ikke hemmet ved tilsetning av DMSO (figur 1B). Flere konsentrasjoner av terpinen-4-ol (0,005% -0,1%) med og uten DMSO ble testet (data ikke vist), og ble observert forskjell i virkningen av DMSO hovedsakelig ved høyere doser av terpinen-4-ol. DMSO virket forstyrre eller inhibere den biologiske effekt av terpinen-4-ol, kanskje ved å hemme absorpsjon av denne biologisk aktivt molekyl.
terpinen-4-ol som et anti-cancermiddel
terpinen -4-ol hemmet veksten av kolorektal (figur 2A), bukspyttkjertel (figur 2B), mage (figur 2C) og prostata (figur 2D) cancere i en doseavhengig måte [10% (i 0,005%) – 90 (i 0,1%) vekstinhibering)], målt kvalitativt ved mikroskopiske observasjoner (data ikke vist), og kvantitativt ved den enzymatiske MTT-analysen (figur 2).
1×10
4 HCT116, DLD1, HT29 og Colo320 CRC (A), ble MIA PACA-, Colo357 og Panc-1 bukspyttkjertelen (B), AGS gastrisk (C), og DU145 og CL-1 prostatakreftceller (D) sås i 96-brønns plater i fullstendig medium. Flere konsentrasjoner av terpinen-4-ol [0,005%, 0,01%, 0,05 og 0,1% (v /v)] ble tilsatt til cellene på den neste dag. Celleoverlevelse ble bedømt ved hjelp av enzymatisk MTT-analyse 72 timer etter behandlingen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. *
P
.
05
, **
P
.
005
terpinen-4-ol induserer apoptose og ikke nekrose
Lave konsentrasjoner av terpinen-4-ol (0,005 til 0,01%) hemmet HCT116 celle spredning i en beskjeden måte (20-30%) målt ved hjelp av MTT-analysen levedyktighet. Høye konsentrasjoner (0,05-0,1%), indusert massiv celledød (75-90%). Som det kan ses i figur 3, er apoptose celledød mekanismen som er ansvarlig for den cytotoksiske effekt indusert ved terpinen-4-ol. Tidlig apoptotisk død indusert ved lav dose av terpinen-4-ol, mens prosentandelen av sent apoptose øket ved høyere konsentrasjoner. Det er ingen nekrotiske celler ble observert.
1×10
5 HCT116-celler ble sådd ut i 12-brønns plater i fullstendig medium og utsatt for forskjellige konsentrasjoner av terpinen-4-ol i 72 timer. Celledød ble målt ved FACS etter farging med Annexin V og PI fargestoffer. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. *
P
.
05
, **
P
.
005
Forbedring av terpinen-4-ol effekt
terpinen-4-ol ble kombinert med forskjellige typer konvensjonell kjemoterapi, avhengig av hvilken type kreft som behandles. For CRC terapi, ble terpinen-4-ol i kombinasjon med oxaliplatin (figur 4A) og 5-FU (figur 4B). En imponerende synergistisk vekstinhibering effekt ble oppnådd (83% og 91%, for oksaliplatin og 5-FU, henholdsvis) i den kombinerte diett sammenlignet med hvert middel alene [12% (oksaliplatin), 25% (terpinen-4-ol) og 20% (5-FU)]. Disse resultatene har oppnådd statistisk signifikans,
P 0
005
.. Lignende resultater ble oppnådd i kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 4C-4F). Terpinen-4-ol imponerende økte effekten av gemcitabin og som Tarceva (60-85% celledød).
1×10
4 CR DLD1-celler (A, B), og pankreatisk MIA PACA-( C, D) og Panc-1 (E, F) celler ble sådd i 96-brønns plater i fullstendig medium. På den neste dag, oksaliplatin i en konsentrasjon på 0,2 uM og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01% (A), 5-FU i en konsentrasjon på 0.3μM og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01% ( B), gemcitabin ved en konsentrasjon på 0,1 gM og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01%, (C) gemcitabin ved en konsentrasjon på 0,1 gM, erlotinib hydroklorider (Tarceva
®) i en konsentrasjon på 0,1 gM, og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01% (D), gemcitabin i en konsentrasjon på 1 uM og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01% (E), gemcitabin ved en konsentrasjon på 1 um, anderlotinib hydroklorider (Tarceva
®) i en konsentrasjon på 0,1 gM, og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01% (F) ble tilsatt i 72 timer. Celleoverlevelse ble bedømt ved den enzymatiske MTT-analysen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. *
P
.
05
, **
P
.
05
Forbedret cytotoksisitet av terpinen-4-ol med biologiske midler
Kombinere terpinen-4-ol med enten humanisert anti-CD24 antistoffet (Arber s lab, Tel Aviv, Israel) eller kimære anti EGFR-antistoff (Cetuximab, Merck Serono) resulterte i en bemerkelsesverdig synergistisk veksthemming effekt (85-90%,
P . 0
005
) på human CRC (figur 5A og 5B) og prostata kreftceller (figur 5C og 5D).
1×10
4 CR DLD1 og HCT116-celler (A, B, E), og prostata CL-1 (C, D) celler ble sådd i 96-brønns plater i fullstendig medium. På den neste dag, terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01%, og de humaniserte anti-CD24-antistoffer (150μg /ml) (A, C), og terpinen-4-ol ved en konsentrasjon på 0,01% og cetuximab ved en konsentrasjonen av 1 um (B, D, E) ble tilsatt i 72 timer. Celleoverlevelse ble bedømt ved den enzymatiske MTT-analysen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. (F) 0.4X10
6 HCT116-celler ble sådd ut i 6-brønns plater i triplikater. Neste dag, kotransfeksjonen med Py4-SV40-LUC vektor og PRL-CMV ble utført. 24 timer etter transfeksjon ble mediet erstattet og cellene ble utsatt for cetuximab, forskjellig konsentrasjon av terpinen-4-ol eller ubehandlet. Luc-analysen ble utført 48 timer etter etter behandlingen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av et sett av data som er bestemt in triplo. *
P
.
05
, **
P
.
05
terpinen-4-ol gjenoppretter følsomheten til
K-ras
muterte kreftceller til å ceteximub
DLD1 CRC celler bærer en mutasjon i
KRAS
onkogen. Derfor er de resistente mot anti-epidermal vekstfaktor (EGFR) terapi. Ved å kombinere terpinen-4-ol (0,01%) med cetuximab (1 uM) resulterte i en ganske imponerende effekt av en veksthemming 85-90%. Disse resultatene ble bekreftet i en annen
KRAS
mutert CRC cellelinje (HCT116) (figur 5E), med en 80% veksthemming (
P . 0
005
) for kombinasjonsbehandling.
Redusert aktivitet av
K-ras
signalveien med terpinen-4-ol
for det formålet vi brukte (Ets /AP1)
4 RAS-responsive element (Py4) konstruksjon, som vi tidligere hadde konstruert [24-26]. Aktiviteten av
KRAS
veien ble evaluert i muterte CRC celler (HCT116) (figur 5F). Transfeksjon med Py4-SV40-Luc aktivitet i nærvær av terpinen-4-ol (0,005 og 0,01%) var 1,3 og 1,5 ganger lavere i forhold til aktiviteten i sitt fravær (
P . 0
05
) _. Ingen effekt ble observert etter eksponering for cetuximab (1 mm).
Hemming av underhudsfett DLD1 tumorvekst hos mus ved terpinen-4-ol
Deretter testet vi potensialet anti-tumor aktivitet terpinen-4-ol
in vivo
. Intratumoral injeksjon (5 injeksjoner) av forbindelsen (0,1% og 1%) ble gitt to ganger per uke i nakne mus (n = 6) som bærer xenotransplantater av CRC DLD1 celler. Behandlingen ble startet da tumorer var 0,3-0,5 cm
3. Signifikant inhibering av tumorutvikling ble observert; 40% og 70% reduksjon i tumorvolum og omtrent 25% og 50% reduksjon av tumorvekt (figur 6A). Disse resultatene ble bekreftet i et annet eksperiment (figur 6B). ble ikke sett noen signifikante bivirkninger (data ikke vist).
eksponentielt voksende DLD1 kreftceller ble høstet og resuspendert ved en endelig konsentrasjon på 5×10
6 celler per 0,1 ml PBS per injeksjon. Når tumorene var håndgripelig, ble musene tilfeldig delt i grupper og behandlingen ble startet [intratumorale injeksjoner av terpinen-4-ol (A, B) eller intratumorale injeksjoner av terpinen-4-ol og intraperitoneale injeksjoner av cetuximab (C)] . Musene ble behandlet to ganger ukentlig. De ble veiet og tumorvolum ble målt med en passer etter 3 dager med start fra begynnelsen av behandlingen med terpinen-4-ol. Tumorvolumet i forhold til tiden for behandling ble plottet. Ved slutten av eksperimentet ble musene bedøvet og avlivet ved cervikal dislokasjon og tumorene ble skåret ut og målt med hensyn til volum og vekt. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SD. *
P
.
05
, **
P
.
005
Kombinert veksthemming av subkutane svulster hos mus
Når en svulst diameter nådde størrelse på 0,5 mm intratumorale injeksjoner av terpinen-4-ol (0,1%) sammen med systemisk (IP) administrering av cetuximab (10 mg /kg) resulterte i en betydelig reduksjon i tumorvolum (62% ± 2,5%,
P . 0
05
) og vekt (62,5% ± 3%,
P . 0
05
) (figur 6C)
design av en mer effektiv formulering av terpinen-4- ol
To ulike formuleringer av terpinen-4-ol ble evaluert
in vivo
, en nano og suspensjon formuleringer. Den sistnevnte dukket opp som å være mer effektiv og tryggere (data ikke vist). Systemisk administrasjon av suspensjonen (1 og 4 mg) til mus som bærer xenografter av CRC (HCT116-celler) resulterte i en imponerende reduksjon i tumorvolum (32% ± 1,1%,
P . 0
05 Hotell og 72% ± 0,7%,
P . 0
005
, henholdsvis) og vekt (26% ± 1,19 og 70% ± 0,71%,
P 0
.
005
, henholdsvis) på en doseavhengig måte (figur 7).
Eksponensielt voksende HCT116 kreftceller ble høstet og resuspendert ved en sluttkonsentrasjon på 5×10
6 celler per 0,1 ml PBS per injeksjon. Når tumorene var følbar, ble musene tilfeldig delt inn i 3groups og behandling, som består av intraperitoneale injeksjoner av terpinen-4-ol (1 og 4 mg /kg), ble startet. Musene ble behandlet to ganger ukentlig. De ble veiet og tumorvolum ble målt med en passer etter 3 dager med start fra begynnelsen av behandlingen med terpinen-4-ol. Tumorvolumet i forhold til tiden for behandling ble plottet. Ved slutten av eksperimentet ble musene bedøvet og avlivet ved cervikal dislokasjon og tumorene ble skåret ut og målt med hensyn til volum og vekt. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SD. *
P
.
05
, **
P
.
005
Diskusjoner
kreft effekter av terpinen-4-ol er imponerende i ulike typer kreftceller både
in vitro
og
in vivo
.
terpinen-4-ol er en viktig komponent av essensielle oljen stammer fra flere aromatiske planter. Den brukes som en anti-inflammatorisk og antioksydasjonsmiddel [27-29]. Bidraget av terpinen-4-ol som et anti-cancer middel og de underliggende signalveier av forskjellige typer av celledød er ukjent. Heri er det vist at virkningsmekanismen til terpinen-4-ol er induksjon av apoptose og nekrose ikke. Det er også vist at terpinen-4-ol og diverse anticancermidler viser en synergistisk veksthemmende virkning ved å redusere overlevelsen av forskjellige kreftcellelinjer. Slike kombinasjoner kanskje forventet å være mer effektive og mindre giftige siden lavere legemiddelkonsentrasjon kan brukes til å behandle et bredt spekter av kreftformer.
Av notatet, gjenopprette følsomhet for anti-EGFR terapi (f.eks cetuximab), i CRC tilfeller bærer
KRAS
mutasjon, når det gis sammen med terpinen-4-ol har et fortrinn klinisk betydning. Det er demonstrert ved å måle aktiviteten av ras-responsive promoter før og etter eksponering for terpinen-4-ol. Det er vist at det promoter-aktivitet ble signifikant redusert ved eksponering for Terpenin-4-ol. Dette interessant og viktig observasjon må bekreftes i videre laboratoriestudier før fører til noen klinisk bruk av terpinuin-4-ol.
Injeksjon av terpinen-4-ol inn i svulsten bemerkelsesverdig hemmet tumorvekst uten noen vesentlig negativ effekter. I søken etter mer praktiske administrasjonsveier, ble to farmasøytiske formuleringer forberedt og testet for systemisk administrasjon, nano formulering og suspensjon. Nano formuleringer økt areal og derfor dramatisk forbedret vannløselighet, biotilgjengelighet, effektivitet og effektivitet. Suspensjonen formen var sammensatt av små dråper /molekyler av den terapeutisk aktive ingrediensen (oljen) i et suspensjonsmedium. Siden nanodrops var assosiert med alvorlig toksisitet (tap av kroppsvekt, dødelighet), ble suspensjonen tilnærming som var fri for bivirkninger valgt for videre undersøkelse. Systemisk administrasjon av terpinen-4-ol ved å suspensjonen ble assosiert med en signifikant reduksjon i tumorstørrelse i de eksperimentelle nakne mus.
I sammendrag, bruk av en kombinasjon av plante-avledet anticancer stoffer og kjemoterapeutiske eller biologisk midler for behandling av forskjellige typer kreft er lovende, med en synergistisk effekt som gjør at en lavere konsentrasjon av kjemoterapi og biologiske midler som ikke bare kan øke effekten, men kan redusere toksisiteten i tillegg. Viktigst terpinen-4-ol stor fordel er evnen til å gjenopprette følsomheten til EGFR-antagonister i svulster med
Ras
mutasjoner.
Takk
Forfatterne er takknemlige til Esther Eshkol, den institusjonelle medisinsk copyeditor, for grundig redigering av vår avis.
