Abstract
Den kliniske suksess for adoptiv immunterapi av kreft er avhengig av valg av mål antigener som er høyt uttrykt i kreftceller, men fraværende i viktige normalt vev. En gruppe av gener som koder for kreft /testis eller kreft kimlinje-antigener er blitt foreslått som ideelle mål for immunterapi på grunn av deres høye ekspresjon i flere krefttyper og deres begrensede ekspresjon i immunologisk normale vev. I det foreliggende arbeid rapporterer vi isolering og karakterisering av humane T-cellereseptorer (TCR) med spesifisitet for synovial sarcom X knekkpunkt 2 (SSX2), en kreft /testikkel antigen uttrykt i melanom, prostatakreft, lymfom, multippelt myelom og kreft i bukspyttkjertelen, blant andre svulster. Vi isolerte syv HLA-A2 begrensede T-celle-reseptorer fra naturlige T-cellekloner avledet fra tumor-infiltrert lymfeknuter av to melanomapasienter SSX2-seropositive, og valgt fire TCR for kloning inn i retrovirale vektorer. Perifere blod lymfocytter (PBL) transduced med tre av fire SSX2 TCR viste SSX2
41-49 (KASEKIFYV) peptid spesifikk reaktivitet, tumorcelle anerkjennelse og tetramer bindende. En av disse, TCR-5, oppviste tetramer binding i både CD4 og CD8-celler og ble valgt for videre studier. Antigen-spesifikk og HLA-A * 0201-begrenset interferon-γ frigivelse, cellelysering og lymfocyttproliferasjon ble observert etter kultur av TCR konstruert human PBL med relevant tumorcellelinjer. Kodon optimalisering ble funnet å øke TCR-5 ekspresjon i transduserte T-celler, og denne konstruksjon har blitt valgt for utvikling av kliniske karakteren virusvektorproduserende celler. Svulsten spesifikke mønster av uttrykk for SSX2, sammen med den potente og selektive aktivitet av TCR-5, gjør dette TCR en attraktiv kandidat for potensiell TCR genterapi for å behandle flere kreft histologier
Citation. Abate-Daga D, Speiser DE, Chinnasamy N, Zheng Z, Xu H, Feldman SA, et al. (2014) Utvikling av en T-celle reseptor Målrette en HLA-A * 0201 Restricted epitop fra Kreft-testikler Antigen SSX2 for adoptiv immunterapi av kreft. PLoS ONE 9 (3): e93321. doi: 10,1371 /journal.pone.0093321
Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 13 desember 2013; Godkjent: 04.03.2014; Publisert: 28 mars 2014
Copyright: © 2014. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet delvis av et bidrag fra Milstein Family Foundation og av egenutført Research Program for Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda MD. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylige fremskritt på områdene immunologi tumor, har kreftgenom og gen-overføringsteknologi muliggjort utviklingen av terapier basert på adoptiv overføring av autologe tumor-reaktive T-celler for behandling av humane maligniteter [1], [2- ]. Tumor-reaktive T-celler kan være naturlig, som i tilfelle av tumor infiltrerende lymfocytter (TIL) renset fra resekterte lesjoner og stimulert
ex vivo
, eller dannet fra perifert blod ved innføringen av gener som koder for immun-reseptorer [3- ].
Mens den høye frekvensen (50-70%) av objektive kliniske respons oppnådd av tIL behandling hos pasienter med avansert stadium melanom etablert et solid bevis på konseptet for behandling av kreft hos mennesker med T-celler [4 ], [5], er dens utbredte anvendelse begrenset av vanskeligheten i dyrknings og utvide disse T-celler til klinisk relevante tall for hver pasient. Som et alternativ tilnærming, kan antigenspesifisiteten av lett tilgjengelige perifere blod-T-celler bli omdirigert til antigener uttrykt i tumorceller ved genetisk modifisering. Adoptiv overføring av autologe T-celler konstruert for å uttrykke T-cellereseptorer (TCR) eller antistoff-avledede kimære immun-reseptorer kan gi en potent cellulær immunrespons mot vev som uttrykker de målantigener, selv ved lave nivåer [3], [6] – [ ,,,0],8]. Det er derfor medvirkende til nøye å velge antigener som er uttrykt i tumorceller, men fraværende fra essensielle normale vev, for å unngå uønskede on-target /off-tumor toksisitet.
Aktuelle forsøk på å identifisere de optimale målantigener for adoptiv immunterapi er i hovedsak fokusert på neoantigener generert av somatiske mutasjoner som er tilstede i tumorer, men fraværende i normalt vev [9], [10], på antigener uttrykt på unnværlig normale vev, og i en gruppe av gener som koder for kreft-testis ( CT) antigener. Sistnevnte er definert ved deres mønster av uttrykk som, hos voksne, er vanligvis begrenset til ikke-MHC-uttrykkende bakterieceller i testikkel, som således ikke tilstede antigener til T-celler, og til tumorceller av diverse opprinnelse [11] – [13 ]. Adoptiv overføring av autologe perifere blod-lymfocytter som uttrykker en TCR som er spesifikt for en cancer-testikkel antigen, NY-ESO-1, mediert objektive tumor-regresjoner hos pasienter med fremskreden melanom og med synovial celle sarkom, uten NY-ESO-1-beslektet toksisitet [14 ].
for å utvide repertoaret av antigener som kan være målrettet med denne tilnærmingen, derfor utvide antall pasienter og krefttyper som kan behandles, har vi utviklet en TCR-uttrykke vektor rettet mot et medlem av synovial sarkom X stoppunkt familie, SSX2. Synovial sarcom X knekkpunkt (SSX) gener er lokalisert på X-kromosomet, og kode for en familie av ti høyt homologe kjerneproteiner, SSX1-10. SSX2 ble opprinnelig identifisert som en del av en genomisk trans til stede i synovial sarcom [15], [16] og senere funnet å være identisk med HOM-MEL-40, et immunogent protein som er kjent for å fremkalle spontan antistoffresponser hos 10% av pasienter med melanom [17].
Vi ga retrovirale vektorer som koder TCR alfa- og betakjeder rettet mot HLA-A * 0201-begrenset epitop SSX2
41-49, isolert fra tidligere beskrevet melanom pasienter viser aktiv immun svar på SSX2 [18]. Vi har videre vist at T-celler konstruert med disse vektorene gjenkjenner cellelinjer avledet fra forskjellige kreft histologier. Optimalisering av TCR ekspresjon og aktivitet ved modifikasjon av dets nukleotidsekvens tillot oss å identifisere optimal utforming for effektiv ekspresjon og potent antigen-spesifikk reaktivitet mot SSX2. Produksjon av en klinisk kvalitet retroviral vektor produsent cellelinje ble videre forfulgt for sin fremtidig anvendelse i adoptiv immunterapi kliniske studier.
Materialer og metoder
Cellelinjer og humane PBL
HLA-A * 0201 + /SSX2 + melanoma cellelinje 624, og ikke-HLA-A * 0201 cellelinjer 888 og 938 ble etablert fra kirurgisk resected metastatisk melanom svulster og opprettholdt på Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health ( Bethesda, MD). HLA-A * 0201 + /SSX2 + glioma cellelinje U251 ble hentet fra Seksjon for kreft behandling og diagnostisering Tumor Repository, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Frederick, MD). Melanom linjer SKmel23 og SKmel37, og brystkreft cellelinje MCF7 ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). COS7-A * 0201 og 293-A * 0201-celler ble retroviralt konstruert for å uttrykke HLA-A * 0201 som tidligere beskrevet [19], [20]. COS7-A * 0201-SSX2 og 293-A * 0201-SSX2 celler ble transdusert med en retroviral vektor som uttrykker cDNA av SSX2. T2 er en lymfoblastoid cellelinje mangler TAP-funksjonen, hvis HLA klasse I proteiner kan enkelt lastes med eksogene peptider. PG13 emballasje kloner ble generert ved hjelp av PG13 gibbon ape leukemi virus emballasje cellelinje (ATCC CRL-10686), og den menneskelige ecotropiske emballasje cellelinje, Phoenix ECO (vennlig levert av Dr. Hans-Peter Kiem, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle , WA). Alle celler ble dyrket i D10 medium som består av høy-glukose (4,5 g /l), Dulbeccos modifiserte essensielle medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, Logan, UT) og 6 mM glutamin (sluttkonsentrasjon, Invitrogen, Carlsbad, CA). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO
2.
perifert blod lymfocytter brukt i denne studien ble innhentet fra melanom pasienter behandlet i Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, på NCI Institutional Review Board-godkjente protokoller. Pasienter gitt skriftlig samtykke til anskaffelse av vev og bruk av disse for forskningsformål, som beskrevet i protokollen 03-C-0277. Humane lymfocytter ble opprettholdt i AIM-V medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 5% humant AB-serum (dalen Biomedical, Winchester, VA), 50 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin (Invitrogen), og 300 IE /mL IL-2 og holdt ved 37 ° C med 5% CO2. SSX2 spesifikk T-celle kloner ble nylig generert fra tumor infiltrert lymfeknute-avledet T-celler hos pasienter Lau 567 og Lau 672, på samme måte som beskrevet tidligere [18].
Syntetiske peptider
SSX2
41-49 peptid (KASEKIFYV) svarende til aminosyrer 41-49 av SSX2, og homologe peptider avledet fra SSX1 (KYSEKISYV), SSX3 (KVSEKIVYV), SSX4 (KSSEKIVYV), SSX5 (KASEKIIYV), SSX6 (KFSEKISCV), SSX7 (KSLEKISYV), SSX8 (KYSEKISYV), SSX9 (KSSEKIIYV), SSX10 (KASEKILYV), IGSF22 (KESAKIFYD), ARHGAP1 (KFGQKIFYV), GPR82 (SCYEKIFYG), PHF8 (LKGEKIFYL), LIPM (TGQEKIYYV), SYT14 (IVGEKIFYL), TCOF1 (KASEKILQV), RBL2 (SPREKIFYY) og FRAS1 (SPREKIYYV) ble syntetisert ved GenScript (Piscataway, NJ). Peptider ble oppløst i DMSO og fortynnet i RPMI 1640-medium for lasting av T2 celler. Binding affinitet til HLA-A2 * 0201 ble spådd for hvert peptid ved hjelp NetMHC-3.0 [21]. Identifisering av peptider homologe til SSX2
41-49 med potensial for kryssreaksjon ble utført ved blåse søk (blastp algoritme).
Bygging av retrovirale vektorer for ekspresjon av SSX2-spesifikke HLA-A * 0201-bundne TCR
MSGV1 baserte retrovirale vektorer ble konstruert ved overlappende PCR med alfa- og beta-TCR kjeder arrangert i følgende rekkefølge: TCR alfa-kjeden, linker peptid Furin-SGSGP2A, TCR beta-kjeden som tidligere beskrevet [22]. De klonede TCR inserts ble verifisert ved restriksjonsenzym-profilering og direkte DNA-sekvensering. CDNA som koder for kodon-optimalisert versjon av SSX2-spesifikke TCR og et kodon-optimalisert TCR med murine konstante regioner ble syntetisert ved GenScript. Den menneskelige-mus hybrid versjon av TCR-5 er designet som tidligere beskrevet [23].
T-celle transduksjon
Retrovirale supernatanter ble generert ved trans hver pMSGV1-SSX2-TCR plasmid sammen med en vektor koding RD114 konvolutt i 293-GP celler ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i Opti-MEM medium (Invitrogen) [22]. Virale supernatanter ble deretter applisert på RetroNectin-belagt (Takara Bio, Japan) ikke-vevs-kultur-behandlet seks-brønns plater. PBL ble stimulert med OKT3 (50 ng /ml) og rhIL-2 (300 IU /ml) 48 timer før transduksjon, og transduksjon ble utført som beskrevet tidligere [24].
Tetramer farging
HLA-A * 0201-begrenset SSX2-avledet peptid SSX2
41-49 (KASEKIFYV) ble produsert av National Institutes of Health Tetramer Kjerne Facility ved Emory University (Atlanta, Georgia) bruker fysoerytrin (PE) som den fluorochrome. For vurdering av TCR transduksjon effektivitet i T-celle-undergrupper, ble transduserte T-celler farget med et FITC-merket anti-human CD8 (BD Pharmingen, San Jose, CA) og med PE-merkede HLA-A * 0201-tetramerene. Celler ble analysert ved hjelp av en FACScan flowcytometer med Cellquest programvare (BD Biosciences) eller FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon).
cytokine release assay
TCR-omsatte lymfocytter ble testet for antigenet -spesifikke reaktivitet i cytokine release analyser ved hjelp av peptid-lastet T2 celler eller kreftceller. For dette formål, ble effektorceller og målceller cocultured ved et 01:01 forhold (1 x 10
5 av hver) i 200 pl av AIM-V medium i to brønner på en 96-brønners mikroplate. Kultursupernatanter ble høstet 18-24 timer etter oppstart av coculture og analysert for interferon-γ (IFNg) ved ELISA (Thermo Scientific).
[
51 Cr] utgivelsen analysen
evne transduced PBLs å lysere HLA-A * 0201 + SSX2 + kreftceller ble vurdert ved hjelp av en standard [
51 Cr] utgivelsen analysen som tidligere beskrevet [25] i korthet TCR-utviklet PBLs ble dyrket med synkende prosenter av
51Cr-merkede målceller (E: T ratio) i AIM-V medium i 96-brønners U-plater ved 37 ° C i 4 timer. Lysis ble målt ved [
51 Cr] utgivelse i medium i henhold til formelen: prosent lysis = (prøve release – minimum release) /(maks release – minimum release) x 100%. Resultatene uttrykt som gjennomsnittet av duplikate prøver.
Generering av en PG13 emballasje klon som koder for en SSX2 spesifikk TCR
A PG13 retroviral pakkende celle klon ble dannet som tidligere beskrevet med de følgende endringer [24] . Phoenix ECO-celler ble transfektert med 9,5 ug av plasmid-DNA (pMSGV1-SSX2.567.5-co) ved anvendelse av Lipofectamine 2000CD transfeksjon reagens (Life, Carlsbad, CA). Etter 48 timer ble supernatanten innhøstet og brukt til å transdusere retroviral pakkende cellelinje, PG13. Ikke-vevskultur behandlede 6-brønners plater belagt med 20 pg /ml RetroNectin som beskrevet av produsenten. Retroviral vektor supernatant (4 ml) ble tilsatt til hver brønn, etterfulgt av sentrifugering (2000 x g) ved 32 ° C. Etter 2 timer ble supernatanten fjernet, og 5 x 10
5 PG13 celler ble tilsatt til brønnen, sentrifugert (1000 x g) i 10 minutter ved 32 ° C. To runder med transduksjon ble utført og deretter PG13 emballasje kloner ble generert ved å begrense fortynning kloning. På grunn av mangel på en selekterbar markør, ble høye titer kloner identifisert av RNA dot blot som tidligere beskrevet [24], [26]. Retroviral vektor fra de 6 høyeste titer kloner ble dannet som beskrevet. I korthet, 175 cm
2 vevsdyrkingskolber (Nunc, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) ble sådd ut ved 4 x 10
4 celler /cm
2, fulgt av et medium utveksling (30 ml) på dag 3. supernatanten ble høstet 24 timer senere, alikvotert og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Supernatant fra hver klon ble evaluert for evnen til effektivt å omsette humant PBL og fremkaller IFNg i et cytokin frigivelse assay. En høy titer klone vil bli valgt for produksjon av en master cellen bank og påfølgende GMP retroviral vektor supernatanten.
Generering av GMP retroviral vektor supernatanten
Det er totalt 26 1700 cm
2 ekspandert overflaterulleflasker ble sådd ut på dag 0 ved en celletetthet på 4 x 10
4 celler /cm
2 i 200 ml D10 medium. På dag 3 ble mediet byttet ut og erstattet med 120 ml D10 medium. Medium inneholdende retrovirale vektor ble høstet daglig med flasker blir igjen foret med 120 ml medium. Blodsukkeret ble overvåket daglig bruker Roche Accu-sjekk system (Roche, Basal, Sveits). Hvis glukosenivåer falt under 2 g /l, ble volumet av mediet utveksling doblet til 240 ml /rulleflaske for alle påfølgende avlinger. Alle avlinger ble alikvotert og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. En alikvot fra hver avling ble testet for transduksjon effektivitet og cytokin frigivelse som beskrevet tidligere. Alle kliniske produkter ble utsatt for et omfattende biosikkerhet testprogram i samsvar med gjeldende lover og forskrifter (US Food and Drug Administration, Senter for Biologics evaluering og forskning, referansepunkter for å vurdere i produksjon og testing av nye legemidler og Biologicals produsert ved rekombinant DNA-teknologi , 1985; Poeng å vurdere i Karakterisering av cellelinjer brukes til å produsere Biologiske, 1993; Guidance for Industry: Veiledning for menneskelig somatisk celleterapi og Gene Therapy, 1998, Veiledning for industri, inds – tilnærminger til Holde CGMP i fase i, 2006).
Resultater
Kloning av menneske SSX2-reaktivt TCR
De kodende områder av TCR alfa- og betakjedene ble klonet fra tidligere beskrevet naturlig forekommende SSX2-reaktivt T-celler fra to melanomapasienter [18]. Disse HLA-A2-begrensede CD8-celler som gjenkjenner en epitop som strekker seg rester 41 til 49. cDNA ble syntetisert ved 5’RACE ved hjelp av primere som var spesifikke for den konstante region av TCR gener og produktene ble sekvensert, identifisering av syv forskjellige par TRAV og TRBV gener ( tabell 1). Ekspresjonskassetter som inneholder alfa- og beta-TCR-kjedene adskilt av den 2A linkerpeptid [27], [28] ble samlet ved overlappende PCR og klonet inn i pMSGV1 for generering av retrovirale ekspresjonsvektorer for kloner 5, 8, 9 og 11 ( figur 1A).
den kodende region av hver TCR a-kjeden ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av primere, flankert av et Ncol-restriksjonssete i 5′-enden og en overhengende sekvensering inneholdende element i 3′-enden. Parallelt ble hver TCR p-kjede amplifisert ved PCR ved anvendelse av en fremre primer inneholdende en 5′-overheng som overlapper med det 3′-overhenget som er tilstede i primeren anvendt for amplifikasjon av alfa-kjeden. Den reverse primeren anvendt for amplifikasjon av beta-kjeden inneholdt et stoppkodon og en
Eco
RI restriksjonssete. I en andre runde av PCR, ble produktene av alfa- og beta-kjeden amplifikasjoner slått sammen, og ligering av begge cDNA-fragmenter gjennom de overlappende overhengene ble oppnådd ved PCR ved bruk av eksterne primere. De resulterende PCR-produkter ble klonet inn i vektor pMSGV1 for retrovirusproduksjon. LTR: long terminal repeat, sd: spleisedonoren, sa: spleiseakseptoren, ψ. Retrovirus encapsidation signal
Expression av klonede TCR i humane lymfocytter
Retrovirale vektor supernatanter ble samlet ved transient transfeksjon av 293GP og anvendes for transduksjon av OKT3-stimulerte humane T-celler. Uttrykk og riktig montering av TCR ble evaluert av flowcytometri, ved hjelp av fluorescensmerkede HLA-A2-SSX2
41-49 tetramers. TCR5 ble effektivt uttrykt i både CD8 og CD4-celler, TCR9 og TCR11 ble uttrykt bare i CD8 celler, mens uttrykk for TCR8 ikke ble oppdaget av denne teknikken (figur 2 A).
A) Analyse av overflaten uttrykk for SSX2
41-49-spesifikke TCR i CD8 og CD4 T-cellepopulasjoner ved strømningscytometri. Humane perifere blod mononukleære celler ble stimulert med OKT3 og transdusert med de indikerte retrovirale ekspresjonsvektorer. En uke senere ble cellene farget med anti-human CD3, CD8-antistoffer og med et fluorescensmerket tetramer inneholdende SSX2
41-49 peptid. Resultater fra en donor representative for minst fire uavhengige forsøk. Hendelser inngjerdet på lymfoid, singel, levedyktige, CD3 + celler. B) – D) Konsentrasjon av IFNg i supernatanter av TCR-omsatte T-celler dyrket over natten med de angitte mål (1 × 10
5 effektorer vs 1 × 10
5 mål). Resultatene vises som gjennomsnittet av duplikater for to representative givere av fire. UT:. Untranduced
reaktivitet av PBL transduced med humant anti-SSX2 TCR mot SSX2-positive tumorceller
Riktig behandling og presentasjon av SSX2
41-49 epitop og gjenkjennelse av TCR-konstruert PBL ble testet in vitro ved dyrking av PBL med derivater av COS-7 og HEK293-celler som uttrykker HLA-A * 0201 med eller uten samtidig ekspresjon av antigenet SSX2 (Cos-A2, Cos-A2 SSX2 , 293-A2 og 293-A2 henholdsvis SSX2,). Som vist i figur 2B, T-celler transdusert med TCR-5, -9 og -11 sekreterte høye nivåer av IFNg (i størrelsesorden 1 x 10
4 pg /ml) når cocultured med SSX2-transfektanter. TCR-8-transduserte T-celler utskilte kun bakgrunnsnivåer av IFNg, i tråd med mangel på tetramer-binding er vist i figur 2A. For å verifisere HLA-A * 0201 begrensning av disse TCR, en SSX2-positiv HLA-A * 0201-negative melanoma cellelinje (938) eller dens deriverte konstruert for å gi uttrykk for HLA-A * 0201 (938-A2) ble brukt som mål for coculture eksperimenter. Som vist i figur 2C, lymfocytter, som uttrykker TCR-5, -9 og -11 utskilt IFNg bare når de dyrkes i nærvær av 938-A2-celler. Anerkjennelse av 938-A2 endogen SSX2 var sterkere i TCR-5-omsatte lymfocytter, som dokumentert av en 2 ganger høyere IFNg sekresjon av disse cellene sammenlignet med T-celler transduced med TCR-9 og -11 (figur 2C).
for å teste evnen til disse TCR å gjenkjenne den endogene SSX2 uttrykt av tumorceller, dyrket vi PBLs (transduced med TCR-5, -8, -9, -11) med cellelinjer avledet fra melanom (888, SKMEL-23, 624), gliom (U251) og brystkreft (MCF-7). Som vist i figur 2D, TCR-5, -9 og -11 mediert IFNg frigivelse av transduserte lymfocytter når de ble dyrket i nærvær av HLA-A * 0201-positive SSX2-positive tumorceller fra gliomer og melanom. Av notatet, TCR-5 formidlet den sterkeste målet anerkjennelse blant de forskjellige TCR test. Basert på dette, og på den effektive uttrykk i både CD8 og CD4 T-celler, vi valgte TCR-5 for ytterligere karakterisering.
kryssreaksjon med andre medlemmer av SSX familie og ikke-SSX proteiner
SSX familien består av 10 gener som koder for proteiner som er sterkt homologe til hverandre. Spesielt epitopen av SSX2 målrettet av TCR-5 ligger innenfor et av de homologe regioner mellom medlemmer av familien. Som vist i figur 3A, aminosyresekvensen av SSX5 og SSX10 avvike fra SSX2
41-49 i bare en rest; SSX1, SSX3, SSX4, SSX8 og SSX9 avvike fra SSX2
41-49 i to aminosyrer; og SSX6 og SSX7 avvike fra SSX2
41-49 i tre aminosyrer. I tillegg til SSX2 ble SSX3 og SSX5 spådd å binde HLA-A2-molekyler med høy affinitet. Peptider som stammer fra SSX4, SSX7, SSX9 og SSX10 ble spådd å binde seg til HLA-A2 med lavere affinitet. Reaktivitet av TCR-5 mot hver av disse peptidene ble testet i coculture forsøk med humane lymfocytter uttrykker TCR-5 som effektorer og peptid-pulset T2 celler som mål, og utskillelse av IFNg ble vurdert som en markør av antigen anerkjennelse. Mens TCR-5-uttrykkende celler utskilt IFNg når den utsettes for SSX2
41-49 ved lav konsentrasjon av peptid ( 0,01 ng /ml), reagerte de til SSX3-, SSX4-, SSX5-, SSX9- og SSX10- peptider bare når de utsettes for høye konsentrasjoner av peptid (over 10 ng peptid /ml, figur 3 A). Denne forskjellen i reaktivitet av tre til fire størrelsesordener viser at TCR-5 er relativt spesifikk for SSX2
41-49, og antyder at gjenkjenning av celler som uttrykker homologe peptider avledet fra andre SSX gener kan være usannsynlig.
Perifere blod-T-celler som uttrykte TCR-5 ble cocultured over natten med T2-celler som tidligere er pulsert med de serielle fortynninger av de angitte peptider. Resultater av IFNg i kultursupernatantene konsentrasjon er uttrykt som gjennomsnitt av duplikater i et representativt eksperiment. Sekvenssammenstilling av de testede peptidene er vist i figuren for legende A) SSX-familie gener og B) ikke-SSX gener med overlappende sekvenser. IGSF22: immunoglobulin super medlem 22, ARHGAP1: Rho GTPase aktiverende protein 1, GPR82: Sannsynlig G-proteinkoblet reseptor 82, PHF8: histon lysin demetylase PHF8, LIPM: lipase medlem M, SYT14: synaptotagmin-14, TCOF1: sirup protein, RBL2: retinoblastom-lignende protein 2, FRAS1: ekstracellulære matrix protein FRAS1. Prediksjon av bindende affinitet til HLA-A2 * 0201 er vist for hvert peptid, uttrykt som dissosiasjonskonstant (K
D, nM).
Ni ekstra protein-kodende gener ble identifisert ved blåse søk som delvis homolog til SSX2
41-49 epitop: IGSF22, ARHGAP1, GPR82, PHF8, LIPM, SYT14, TCOF1, RBL2 og FRAS1. De overlappende peptider i to av disse proteinene, IGSF22 og TCOF1, skilte seg i bare to rester fra den målrettede SSX2 epitop. I tillegg ble peptider avledet fra SYT14 og TCOF1 anslått til å være sterke og svake HLA-A2 bindemidler, henholdsvis (figur 3B). Vi analyserte anerkjennelse av disse nonamer peptider av TCR-5 i coculture eksperimenter ved hjelp av peptid-pulset T2 celler. Som vist i figur 3B, IFNg frigivelse indusert ved SSX2
41-49 peptidet var to til fire størrelsesordener bedre enn den som induseres av de homologe peptidene, noe som bekrefter spesifisiteten av TCR-5.
Kodon optimalisering og murinization av TCR-5
neste evaluert hvorvidt optimering av kodonbruk i den kodende sekvens av TCR-5 og /eller anvendelse av human-mus-hybrid TCR kunne forbedre TCR-5 ekspresjon og /eller biologisk aktivitet . cDNA som koder for den samme aminosyresekvens som TCR-5, men med en nukleotidsekvens som er optimalisert for kodonbruk hos mennesker ble syntetisert og klonet i pMSGV1 for generering av retrovirale vektorer. Tilsvarende er en kodon-optimalisert versjon av TCR-5, karakterisert ved TCR konstante regioner ble erstattet med den konstante regionen til en mus TCR [23] ble syntetisert og klonet i pMSGV1. De tre versjonene av TCR-5 (WT, kodon optimalisert, og kodon optimalisert + mus konstant region, figur 4A) var ved forhold i sitt uttrykk og evne til å gjenkjenne antigen og formidle cellelyse.
A) Skjematisk framstilling av de tre konstruksjonene ble generert for ekspresjon av TCR-5 og derivater. LTR: long terminal repeat, sd: spleisedonoren, sa: spleiseakseptoren, ψ: retrovirus encapsidation signal, MC: mus TCR konstant region, 2A: linker peptid. B) Analyse av uttrykk av TCR-5 varianter av tetramer farging. OKT3-stimulerte lymfocytter ble transdusert to ganger med det tilsvarende TCR-uttrykkende vektor og farget med anti-CD3, anti-CD8 og SSX2
41-49 tetramerer en uke etter transduksjon. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter. Verdier i parentes representerer den midlere fluorescensintensitet av tetramer farging innenfor den CD8-T-cellepopulasjon. C)
51Cr-frigivelse assay for vurdering av antigen-spesifikke cytolyse indusert av TCR-5-transduserte lymfocytter etter fire timers coculture med de indikerte målcellene. Prosentandel av lysis er vist for hvert mål-cellelinje på forskjellige effektor: target-forhold er gjennomsnittet av duplikatene i et representativt eksperiment av tre uavhengige eksperimenter. UT: untransduced T-celler brukt som negativ kontroll med uspesifikke lyse, WT: Wild-type TCR, Co Op: copon-optimalisert TCR, MCR. Kodonoptimalisert TCR med musen konstant region
Etter retroviral transduksjon av OKT3-stimulerte humane lymfocytter, ble tetramer farging anvendt for å vurdere ekspresjon av de tre konstruksjoner. Som vist i figur 4 B, kodon optimalisering økt tetthet av membranen ekspresjon av TCR i CD8 T-celler som gjenspeiles ved en øket gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av SSX2
41-49 tetramer farging i celler transdusert med kodonoptimalisert TCR-5 (910 fluorescensenheter), sammenlignet med dem transdusert med vill-type-versjonen (656 fluorescensenheter). Imidlertid, anvendelse av et murint konstant område i tilsetning av kodon optimalisering kun minimal øket til tetramer binding av TCR (949 fluorescensenheter). Den biologiske aktivitet av TCR ble testet i coculture eksperimenter hvor TCR-transduserte lymfocytter ble utsatt for flere HLA-A * 0201-positive målceller som var positive for SSX2 (Cos-A2-SSX2, 293-A2-SSX2, K562- A2, 624, 938-A2 og U251). Konsentrasjonen av IFNg i supernatantene ble målt ved ELISA etter en natts coculture og resultatene er vist i tabell 2. Lymfocytter transdusert med kodon-optimalisert versjon av TCR-5 utskilles i gjennomsnitt 30% mer enn de IFNg transdusert med den vill-type TCR. Tilstedeværelsen av en mus TCR konstant område også øket IFNg sekresjon i forhold til vill-type TCR, men denne modifikasjon økte ikke IFNg utskillelsen av kodonoptimalisert variant (tabell 2). De tre konstruksjonene vises tilsvarende egenskaper når det gjelder induksjon av antigen-spesifikk proliferasjon av T-celler i tymidinopptaket analyser (figur S1A), T-celleaktivering ved antigen gjenkjennelse (vist ved oppregulering av aktiverings markør CD137, figur S1B) og interleukin -2 (IL-2) produksjon (figur S1C).
Induksjon av cellelysering av tumorceller uttrykker SSX2
evnen til hver variant av TCR-5 til å indusere antigen spesifikk cellelysering av tumor mål med humane lymfocytter ble bestemt ved anvendelse av et kromfrigjøringsanalyse. Krom (
51 Cr) -merket 938, ble 938-A2, Cos-A2, Cos-A2-SSX2, 624, SKmel37 og 888 celler cocultured med humane perifere blod-T-celler transdusert vill-type TCR-5 eller dens kodon -optimized eller kodonoptimalisert murinized varianter, på forskjellige effektor: target forholdstall. Untransduced T-celler ble anvendt som negativ kontroll. Som vist i figur 4 C, lymfocytter transdusert med et av de SSX2
41-49-spesifikke TCR indusert potent cytolytiske effekt på 938-A2-celler, men ikke på 938 celler, noe som indikerer at lysis er HLA-A * 0201-begrenset. I tillegg ble Cos-A2-SSX2 celler lysert ved TCR-5-uttrykkende celler, men ikke Cos-A2, som mangler ekspresjon av SSX2, noe som indikerer at denne effekten er antigen-spesifikk. Tilsvarende 624 og SKmel37 celler, som er HLA-A * 0201 positive og naturlig express SSX2, ble lysert ved lymfocytter transduced med enten TCR-5 variant, mens HLA-A * 0201-negative 888 cellene ikke var. Sammen viser disse resultater bekrefter at TCR-5-avledede konstrukter er biologisk funksjonell i humane perifere blod-T-celler, og at de kan brukes til å omdirigere deres antigenspesifisitet til SSX2, i et HLA-A * 0201-spesifikk måte. Verken kodon optimalisering eller murinization av TCR hatt en effekt på TCR-5-mediert lysering.
Utvikling og testing av klinisk karakter retroviral vektor supernatanter
På grunn av svulsten-selektive mønster av uttrykk for SSX2 og potente likevel selektive antigen-gjenkjennelses egenskaper av TCR-5, bestemte vi oss for å produsere og teste klinisk grad av retrovirale vektorer som er egnet for ekspresjon av TCR-5 i perifere blod-T-celler av kreftpasienter. Stabile pakking linjer ble etablert av transduksjon av PG13 celler med en retroviral vektor som koder for kodon-optimalisert versjon av TCR-5. Etter to transductions, ble PG13 celler klones ved begrensende fortynning, og klonene ble testet med hensyn til virus-RNA-ekspresjon ved hjelp av dot-plot (ikke vist). De seks kloner som uttrykker de høyeste nivåene av vektor RNA (A8, A10, C3, D8, F2 og H2) ble amplifisert og supernatantene ble testet for deres evne til å indusere ekspresjon i TCR OKT3-stimulerte PBL fra tre forskjellige givere. Tetramer farging av transduserte T-celler viste at supernatanter fra de seks klonene mediert effektiv transduksjon av lymfocytter (figur 5 A).
