Abstract
Dietary tilskudd av selen og grønn te holder løftet i kreftforebygging. I denne studien evaluerte vi efficacies selen og grønn te administrert individuelt og i kombinasjon mot tykktarmskreft i en azoxymethane (AOM) -indusert rottetykktarmskreft modell og fast de underliggende mekanismene for beskyttelse. Fire-ukers gamle Sprague-Dawley hannrotter ble foret med dietter inneholdende 0,5% grønn te ekstrakt, 1 ppm selen, selen-anriket melkeprotein, eller en kombinasjon av 1 ppm selen og 0,5% grønn te-ekstrakt. Dyr mottatt to AOM (15 mg /kg) behandlinger for å indusere colonic onkogenese. Rottene ble drept 8 eller 30 wk senere etter den siste AOM for å undersøke effekten av kosten intervensjon på avvikende krypten foci (ACF) dannelse eller tumorutvikling. På offer, ble kolon undersøkt for ACF og svulster, de mRNA nivåer av
SFRP5 Hotell og
Cyclin D1
, og proteinene nivåer av ß-catenin, COX-2, Ki-67, DNMT1 og acetyl histon H3. Kombinasjonen av selen og grønn te resulterte i en signifikant inhibering av additiv store ACF dannelse, var denne effekt er større enn enten selen eller grønn te alene,
P
0,01; kombinasjonen hadde også en signifikant inhibering additiv effekt på alle tumor endepunkter, effekten av kombinasjonen diett på tumor forekomst, multiplisitet og størrelsen var større enn selen eller grønn te alene,
P
0,01. Rotter matet kombinasjonen diett viste markert reduksjon av DNMT1 uttrykk og induksjon av histon H3 acetylering, som ble ledsaget av restaurering av
SFRP5
mRNA i normale-vises colonic krypter. Kombinasjonen diett også betydelig redusert ß-catenin kjernefysisk trans,
Cyclin D1
uttrykk og celledeling. Disse data viser for første gang, er mer effektive i å undertrykke kolorektal onkogenese enn noen av midlene alene den kombinasjon av selen og grønn te. Den preventive effekten er knyttet til regulering av genetiske og epigenetiske biomarkører innblandet i kolon kreft
Citation. Hu Y, McIntosh GH, Le Leu RK, Nyskohus LS, Woodman RJ, Young GP (2013) Kombinasjon av selen og green Tea Forbedrer Effekt av Kjemoprevensjon i en rotte tykktarmskreft Model av Moduler Genetiske og epigenetiske biomarkers. PLoS ONE 8 (5): e64362. doi: 10,1371 /journal.pone.0064362
Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 5. desember, 2012; Akseptert: 12. april 2013, Publisert: May 23, 2013
Copyright: © 2013 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av National Health and Medical Research Council stipend og Cancer Council of South Australia (prosjektnummer 1007501 og 525925). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarmskreft (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft død på verdensbasis; annerledes enn andre kreftformer, er viktigheten av miljøeksponering (spesielt diett) i forbindelse med utvikling av CRC streket av det faktum at 50% av årsakssammenheng kan tilskrives familiære faktorer, mens kostholdsfaktorer bidra med opp til 70% [1] . Spesifikke strategier kosten kan vise seg å være verdifull i å beskytte mot kreft [2]. I denne forbindelse er det etablert sammenhenger mellom kosthold og livsstil for CRC forebygging, og det har blitt anslått at 30-50% av CRC kan være potensielt forebygges ved å forbruke et sunt kosthold [3].
I de senere årene , naturlig forekommende stoffer som finnes i det vi spiser eller drikker har trukket mye oppmerksomhet med sitt potensial evne for kreft forebygging og /eller behandling på grunn av sine ulike helsemessige fordeler og bred sikkerhetsmargin [2], [4]. Selen (Se), en viktig spormikronæringsstoffer, og grønn te, er den vanligste drikken inntas over hele verden, har blitt identifisert som kjemopreventive midler for ulike kreftformer. Epidemiologiske, kliniske og prekliniske studier tyder på en invers sammenheng mellom SE inntak, grønn te forbruk og risiko for visse kreft [5] – [7]. Studier med dyremodeller har også vist at Se og grønn te har et bredt spekter av forebyggende aktivitet mot CRC [8] – [10]. Til tross for lovende resultater i prekliniske innstillinger, aktuelle data fra kliniske studier relatert til Se og grønn te tilskudd er ikke overbevisende nok til at en generell anbefaling for bruk av Se eller grønn te som et effektivt middel for chemoprevention av kreft hos mennesker [11] – [13] . Begrensningen av en enkelt kosten middel for effektiv hindring kan skyldes lavere potens av diettmidler, mens det naturlige forbindelser har vist økt aktivitet når de er til stede i en blanding [14]. Det kan være mulig å oppnå additive eller synergistiske forebyggende effekt ved å kombinere diett midler som utøver komplementære mekanismer i deres anti-kreftfremkallende handlinger [2], [15], [16]. Betydelige data fra dyr og humane studier indikerer at kombinasjoner av kosten midler er mer effektive enn en enkelt middel [17], [18]. For eksempel har grønn te vist seg å synergi eller additivt øke effekten av andre legemidler eller kosttilskudd agenter
in vitro Hotell og
in vivo product: [19] -. [22]
til tross for den økende interessen på chemopreventive rollen Se eller grønn te, er det ukjent om kombinasjonen av Se og grønn te har en gunstig chemopreventive effekt på CRC. Selv mangler prekliniske og kliniske rapporter om å kombinere Se og grønn te, tilnærminger kombinasjon med SE eller grønn te har blitt studert i tykktarmskreft og andre kreft modeller [23]. For eksempel, har en kombinasjon av Se og genistein er vist å hemme brystkreft i en rottemodell [24]; en kombinasjon av Se og vitamin E har gitt bedre beskyttelse mot esophageal karsinogenese i rotter [22]. Kombinasjonen av grønn te og curcumin eller kombinasjonen av grønn te og sulindac har resultert i synergistisk effekt Kjemopreventivt i en AOM CRC-modell [25], [26].
Se og grønn te er spesielt interessant som en kombinasjon ikke bare fordi de lett kan administreres samtidig i dietten, men også fordi de har potensielt komplementære virkningsmekanismer. Apoptotisk fjerning og DNA-reparasjon enzym O
6-alkylguanine DNA alkyltransferase (MGMT) -mediert DNA reparasjon er to viktige medfødte cellulære responser på miljø carcinogen-indusert onkogen DNA-lesjoner. Grønn te har vist seg å oppregulerer MGMT-aktivitet i rotte-tykktarm i vår tidligere studie (upubliserte data) ved et epigenetisk mekanisme som ville forventes å reparere den type addukt indusert av azoxymethane (AOM) [27]. Kost Se har blitt vist av vårt team for å aktivere apoptotisk sletting av AOM rammede celler [28]. Vi hypoteser at risikoen for å utvikle CRC vil bli redusert ved å kombinere midler som er rettet mot ulike aspekter av medfødte cellulære responser til onkogene DNA-lesjoner. Dette begrunnes med at CRC har en lang innledende latenstid, involverer flere trinn og stier, og en kombinatoriske tilnærming kan samtidig regulere flere molekylære og cellulære mål som er involvert i prosessen med CRC [29].
økt forståelse av CRC på epigenetiske /genetiske nivåer åpner også opp muligheter for å avbryte og reversere initiering og progresjon av CRC og gir mange mål for kosttilskudd intervensjon [30]. AOM-indusert CRC modellen har vært mye brukt i både mekanistiske og chemepreventive studier [31] fordi det oppsummerer mange av de kliniske, patologiske, og molekylære funksjoner i menneske CRC, som preneoplastiske lesjoner, avvikende krypten foci (ACF), mutasjoner i
K-ras
onkogen, og dereguleringen av signalveier i WNT /ß-catenin og inflammasjon [31], [32]. Selv om rollene til Wnt-antagonister (som utskilles frizzled relaterte proteiner (SFRPs)), DNA metyltransferaser (DNMT) og histon deacetylering i menneskets tarmkreftutvikling er godt dokumentert, uttrykk for DNMT1, SFRR5 og acetylering av histon H3 i denne modellen er i stor grad ukjent; som spiller avgjørende roller i utvikling og progresjon av humane kolon-kreft [33] – [35]. Denne studien ble utformet for å evaluere chemopreventive effekten av å kombinere kosttilskudd agenter av Se og grønn te mot tykktarmskreftutvikling, ved hjelp av ACF og colontumorer som endepunkter. Effekten av denne kombinasjonen på genetiske /epigenetisk biomarkører ble også undersøkt.
Metoder
Reagenser
AOM og grønn te ekstrakt ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Pty. Ltd Green te ekstrakt (P1204) inneholder 65% catechin inkludert 34,5% epigallocatechin gallate (EGCG). Melkeprotein (0.34ppm Se) og Se-beriket melk protein (5ppm Se) ble levert av Tatura Milk Industries (VIC, Australia) [28]. Se-beriket melk protein inneholder 83% selenomethionine, 5% selenocystein og 4% ukjente komponenter [36].
Dyr
Det er totalt 160 Sprague-Dawley rotter ble hentet fra Animal Resource Centre, Adelaide University, Australia. Studien ble godkjent av dyrevernUtvalget ved Flinders University (# 651/07). To forsøk ble utført, 60 rotter i en ACF eksperiment og 100 for en langvarig tumor eksperiment.
For hvert forsøk ble rottene tilfeldig delt inn i 4 like eksperimentelle grupper (med tilsvarende opprinnelige kroppsvekt), plassert i plastbur (fire pr bur) og opprettholdt i et temperatur- og fuktighetskontrollert dyr anlegg med en 12 timers lys /mørke-syklus ved 22 ± 2 ° C temperatur og 80 ± 10% luftfuktighet. Rotter fikk fri tilgang til vann, veies ukentlig og ble overvåket nøye for kliniske tegn på dårlig helse gjennom hele studien. Rotter som vises syk ble avlivet umiddelbart.
Dietter
De eksperimentelle dietter ble basert på en modifisert AIN-76A kosthold og inneholdt 19% solsikkeolje vekt, slik som å «humanisere» fettet bidrag til energiinntaket til ~35% [28]. Melkeprotein ble anvendt som proteinkilde for kontroll og grønn te dietter; Se-anriket melkeproteiner ble anvendt som protein, så vel som en supplerende Se kilde for den høye se diett og kombinasjonen diett; kontroll kosthold inneholdt verken Se eller grønn te. Valget av 0,5% grønn te var basert på vår tidligere studie at denne inntak betydelig økt MGMT uttrykket (mRNA og aktivitet) i rotte-kolon (upubliserte data). Denne dosen inneholder 172,5 mg EGCG /100 g diett og gi 25,9 mg EGCG /rotte /dag, som da beregnet på per kroppsvekt vil gi tilsvarende inntak i et voksent menneske på 3-4 kopper grønn te per dag. Dette fôring regimet ble godt tolerert av dyr [37]. 1 ppm Se ble valgt fordi våre tidligere studier viste at Se-beriket melk protein ved 1 ppm betydelig beskyttet mot tykktarm kreft hos mus [28]. Diettene ble fremstilt fersk ved 4-ukers intervaller, pelletert og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Detaljer om dietter er gitt i tabell 1.
Forsøk 1 (ACF studie)
Begynnelsen på 5 ukers alder, rotter (15 /gruppe) ble gitt til hver av fire dietter . Etter 2 wk på dietter, rotter fikk 2 AOM injeksjoner (15 mg /kg kroppsvekt) en uke fra hverandre. Rotter holdt på den samme diett i løpet av studien inntil drept av CO
2 kvelning 8 uker etter den siste injeksjonen AOM (figur 1A). Kolon ble åpnet flatt over natten på hibond C papir for ACF analyse. Etter analyse ble det distale segment av normal-vises kolon (2 cm) kuttet og farget med Ki-67, COX-2 og β-catenin antistoffer (12 /gruppe)
ACF studie (A).: grupper av rotter (n = 15) ble foret med kontroll, Se, grønn te eller diett inneholdende Se og grønt i en alder av 5 wk. 2 wk senere, rotter fikk 15 (mg /kg /kroppsvekt) AOM, en gang i uken for 2 wk. 8 wk etter siste AOM behandling, ble rottene avlivet og kolon ble evaluert for ACF; normal-vises krypter ble også kontrollert for β-catenin, COX-2 og Ki-67 ekspresjon. Tumor studie (B): grupper av rotter (n = 25) ble matet kontroll, Se, grønn te eller diett inneholdende Se og grønt i en alder av 5 wk. Rotter fikk to ukentlige AOM behandlinger ligner ACF studien. 30 wk etter AOM behandling, ble rottene avlivet og kolon ble historisk evaluert for kreft utfall; normal-vises krypter ble også undersøkt for β-catenin, DNMT1, Ac-H3 samt
SFRP5 Hotell og
Cyclin D1
uttrykk.
Forsøk 2 ( svulst studien)
5 wk gamle rotter (25 /gruppe) ble gitt til hver av fire dietter, ligner ACF studien. Rottene fikk 2 ukentlige AOM injeksjoner (15 mg /kg), men ble drept 30 wk etter den siste AOM (figur 1B). Kolon ble undersøkt for tumor endepunkter og bearbeides videre for histopatologiske evaluering. En distale segment av normal-vises kolon (2 cm) fri av neoplasmer ble dissekert for immunhistokjemi av β-catenin, DNMT1 og acetylert histon H3 (Ac-H3) (12 /gruppe) eller frosset i flytende nitrogen for western blot analyse (6 /gruppe) eller plassert i RNAlater (Ambion) for kvantitativ RT-PCR-analyse (6 /gruppe).
Kvantifisering av ACF
Kolon ble farget med 0,1% metylenblått løsning og evalueres × 40 forstørrelse ved hjelp av en dissekere mikroskop i en blind bedømmelse. Totalt antall ACF i hele tykktarmen ble skåret fra den distale til den proksimale enden av tykktarmen. ACF ble skilles fra de omkringliggende normale krypter av deres økte størrelse, forhøyet utseende og den sliss som formen på den luminale åpningen. Crypt mangfold ble definert som antall krypter i hver fokus, og kategorisert som små (1-3 krypter /fokus) og store ACF (4 eller flere krypter /fokus).
Histopatologi av svulster
antallet, plasseringen og størrelsen på hver svulst ble scoret av en uavhengig observatør uvitende om kosten behandling. Tumorene ble kategorisert som adenomer og adenokarsinomer som tidligere beskrevet av oss [28]. Punktene var kolon tumortilfeller (dvs. andel av rotter med svulster, med adenomer eller adenokarsinomer), tumor mangfold (antall svulster /rotte) og tumorstørrelse (tumor størrelse /rotte). Tumorstørrelse ble beregnet ved formelen:. Log
10 [Σ (π (diameter1 + diameter 2))
2/2] [38]
Immunhistokjemisk analyse
primære antistoffer mot Ki-67 (MIB-5, # M7248) ble kjøpt fra Dako, Australia; COX-2 (M-19-R, # SC-1747-R), β-catenin (E5, # SC-7963) og DNMT1 (H-300 # SC-2701) fra Santa Cruz Biotechnology, Australia og Ac-H3 (Lys9 /Lys14, # 9677) fra Cell signalering, USA. De detaljerte prosedyrer for immunhistokjemisk analyse ble rapportert tidligere [28]. I korte trekk, ble antigenet gjenfinning utføres ved oppvarming av delene i 0,1 M citratbuffer i trykkoker plast kar i 1 time. Seksjoner ble inkubert med Ki-67-antistoff (1:1000), COX-2-antistoff (1:500), β-catenin antistoff (1:1,000), DNMT1 antistoff (1:2,000), og Ac-H3-antistoff (1: 5000) over natten etter inkubasjon i 3% H
2o
2 for 20 minutter. Deteksjon for Ki-67 og COX-2 ble biotinylert sekundært kanin-anti-mus-antistoff (1:200) (Dako) i 30 minutter og avidin /biotinylert peroksidasekompleks (Signet Laboratories) i 20 minutter. Detection for DNMT1 og β-catenin var av en HRP polymer link. Lysbilder ble visualisert ved inkubasjon med 3′-diaminobenzamine underlaget og kontra med hematoksylin. En positiv farging ble identifisert ved en rødbrun bunnfall i kjernen for Ki-67, DNMT1 og Ac-H3, i cytoplasmaet for COX-2 og i membran /kjerne for β-catenin. 20 intakte perpendikulært godt orientert normal-vises krypter (som strekker seg fra den muskulære mucosa til kolon lumen) ble undersøkt for hver prøve kolon. Indeksen for colonic krypten celler som uttrykker Ki-67, COX-2, ble DNMT1 og Ac-H3 beregnet som antall positive celler pr krypten kolonne dividert med det totale antall celler og multiplisert med 100. Membran og kjerne farget β-catenin cellene ble telt separat. Den unormale uttrykk for β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 ble også undersøkt i tumorvev.
Western Blot analyse
Prøver av normal-vises kolon vev fra seks rotter per gruppe ble slått sammen og homogenisert i iskald lyseringsbuffer (50 mM Tris, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF og proteaseinhibitorer) og sentrifugert (14 000 x g i 25 min ved 4 ° C) . Konsentrasjonen av protein i supernatanter ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse. Like mengder av proteiner (30 ug) ble separert på 4-20% SDS-PAGE-geler, ble proteinene overført til en nitrocellulosemembran ved hjelp av semi-tørr overføring og membranen ble blokkert med 5% skummet melk, probet med β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 antistoffer og farget med sekundært antistoff (et pepperrot peroksidase-merket anti-kanin-IgG-eller geite-anti-mus IgG). Western blot ble gjentatt tre ganger for hver prøve. Immunreaktive proteiner ble oppdaget ved hjelp av den forbedrede chemiluminescence lysdetekterende kit. Hver membran ble gjen probet med anti-β-aktin-antistoff (Sigma) eller anti-histon H3-antistoff (# 4499, Cell signalering). Band intensiteter for β-catenin, DNMT1were kvantifisert av Image J og normalisert med β-aktin, mens bandet intensiteten av Ac-H3 ble normalisert med H3 histon. Resultatene er uttrykt som forhold relativt p-aktin eller H3 histon.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra rotte-kolon ved anvendelse av en Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland). Konsentrasjonen og renheten av det totale RNA ble beregnet ved hjelp av en NanoDrop® ND-1000 UV-Vis spektrofotometer ved å måle absorbansen ved 260 og 280 nm. Komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert fra 0,3 ug total RNA for hver prøve ved hjelp av et QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit.
SFRP5 Hotell og
cyclin D1
gener ble co-forsterket med
GAPDH
gen, som fungerte som en husholdningsgenet. Primere for
SFRP5
genet ble kjøpt fra Qiagne, Rn_Sfrp5_1_SG QuantiTect Primer Analyser (NM_001107591, XM_001055342, XM_219887, XM_347305- Cat # QT01624056). Primere for
Cyclin D1
genet (NM_171992) var 5′-ATGAGAACAAGCAGATCATCC-3 «(Forward Primer) og 5′-TAGCAGGAGAGGAAGTTGTTG-3» (Reverse Primer). Primere for
GAPDH
genet (NM_017008) var 5′-AACATCATCCCTGCATCCAC-3 «(Forward Primer) og 5′-TTGAAGTCRCAGGAGACAAC-3» (Reverse Primer). Real-time PCR ble utført med QuantiTect SYBR Grønn PCR Kit på en Rotor Gene 3000 sykler (Corbett, Australia). Sykkel betingelsene for 40 sykluser var 94 ° C /15 s, 55 ° C /30 s og 72 ° C /30 s. Hver prøve ble kjørt i lett gjenta og normalisert ved
GAPDH
. For hver PCR-kjøring, ble en ikke-mal reaksjon inkludert som negative kontroller. Alle PCR data ble analysert med Q-Gene programvare som vi beskrev tidligere [36], [39].
Statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago , Illinois) og Stata versjon 11.1 (StataCorp, Texas). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet for normalfordelte data. Mellom-gruppe sammenligninger for vekt, Ki-67, COX-2, β-catenin, DNMT1, Ac-H3,
SFRP5 Hotell og
Cyclin D1
ble utført ved hjelp av enveis ANOVA med korreksjon for multiple sammenligninger av Tukey sin post hoc test, en
P
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk mellom gruppene. Mellom-gruppe sammenligninger av ACF teller og kreft tiltak ble vurdert i henhold til de 2 × 2 faktorielle design med grønn te og Se som de to viktigste faktorene. Binary logistikk og negative binomiske regresjonsmodeller ble ansatt for å teste for de viktigste effektene av grønn te og Se og for mulige samspilleffekter mellom grønn te og Se. Post-hoc sammenligninger for hver av de 3 intervensjons dietter med kontroll kosthold som sammenligningsgruppen, samt sammenligning for kombinasjonen diett med Se alene eller grønn te alene ble også utført. En
P
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant for hver hovedeffekt og samhandling
Resultater
Generelt observasjon
Dietter ble godt mottatt. og fortært av fire rottegruppene. Alle rotter uavhengig av kostintervensjonsgruppen viste normal vektøkning i løpet av de to forsøkene (data ikke vist); Det var ingen signifikant forskjell i matforbruk mellom diettgruppene. Undersøkelse av tynntarm, lever og nyre avdekket ikke noe unormalt i noen av studiene, noe som indikerer kosttilskudd med 1 ppm Se eller 0,5% grønn te, eller en kombinasjon av Se og grønn te ikke føre til noen åpenbar toksisitet. Seks syke rotter ble drept før avslutningen av svulst studie; de ble fordelt på de tre behandlingsgruppene og kreft endepunkter fra disse rottene ikke var i stand til å bli inkludert.
Kombinasjonen dietten hemmer effektivt ACF-formasjonen i AOM modell
AOM-indusert ACF ble observert hovedsakelig i den distale colon og midten. Effektene av Se, grønn te og kombinasjonen diett på ACF dannelse er vist i tabell 2. Selv om det totale antall ACF /rotte fra vår studie ble noe lavere sammenlignet med andre tidligere publiserte studier [40], rotter foret grønn te alene hadde ingen effekt på total ACF og liten ACF /rotte, selv om det betydelig redusert store ACF /rotte,
P
0,05, sammenlignet med de som er foret med kontrolldietten. I kontrast, ble alle kategorier av ACF krypten mangfold (total, små og store ACF /rotte) signifikant redusert med Se alene (
P
0,05) og kombinasjonen diett (
P
0,05 for kombinasjonen diett mot hverandre av grønn te og Se).
kombinasjonen dietten hemmer effektivt tumordannelse i AOM modell
signifikant reduksjon i antall ACF er i tråd med de lavere tumorbelastninger observert i rottene som fikk kombinasjonen diett (tabell 3). Det var en signifikant interaksjon mellom Se og grønn te,
P
0,05, med en kombinasjon diett som viser additiv hemmende effekt på tumor alle endepunkter i forhold til en enkelt kostmiddel som grønn te eller Se,
P
0,01. Tumor forekomst, mangfold og tumorstørrelse ble redusert med 73,9, 80,4%, 73,4% versus grønn te diett, og med 65,2%, 72,7%, 63% versus Se kosthold, henholdsvis. Grønn te alene ikke vesentlig påvirke noen svulst endepunkt, mens Se alene var mindre effektiv enn kombinasjonen kosthold. Analyse av effekten av kosten intervensjon på kreft dannelsen ble spesielt utført etter histopatologisk undersøkelse av tumorer. Forekomsten av adenom i kontroll, grønn te, Se og kombinasjons dietter var 26,1%, 20,8%, 16,7% og 4,3%, henholdsvis. Det var en betydelig reduksjon i rotter fôret kombinasjonen kosthold, ble det redusert med 79,3% versus grønn te diett, og med 74,2% versus Se kosthold,
P
0,01, henholdsvis. Forekomsten av adenokarsinomer ble redusert i en lignende mønster; 17,4% hos rotter fôret med en kontroll kosthold i forhold til 4,3% i de matet kombinasjonen kosthold, mens i grønn te alene var forekomsten 12,5% og for Se alene var forekomsten 8,3%. Spesielt kombinasjonen diett reduserte forekomsten av adenokarsinomer med 65,6% versus grønn te diett, og med 48,2% versus Se diett, men tallene var liten og resultatene nådde ikke signifikans.
Kombinasjonen diett forhindrer AOM-indusert ß-catenin kjernefysisk translokasjon, COX-2 uttrykk og celleproliferasjon
Effekter av Se, grønn te og kombinasjonen diett på ß-catenin, COX-2 og Ki-67 uttrykk ble undersøkt i histologisk normal-vises krypter fra ACF studien. Vi først sammenlignet fargemønster av ß-catenin mellom AOM-ubehandlet normale krypter og AOM-behandlede krypter. P-catenin farging i normale krypter av ubehandlede rotter viste et lavt nivå av P-catenin fargingen begrenset til cellemembran, med begrenset nukleær farging (figur 2A), mens krypter fra AOM-behandlede rotter viste økt farging av P-catenin i kjernen (figur 2B). Sammenligning av ß-catenin membran og nukleær farging celler for de 4 diettgruppene er vist i figur 2B og fig 2C. Se alene, har grønn te alene og kombinasjonen ikke påvirke den prosentandelen av celler som viser positiv P-catenin membranfarging. Men Se alene (
P
0,05) og kombinasjonen diett (
P
0,01) en signifikant reduksjon i prosentandelen av celler som viser positiv P-catenin nukleær farging, sammenlignet med kontrollen, med ingen signifikant forskjell mellom SE alene og kombinasjonen diett, mens grønn te alene ikke reduserte P-catenin nukleær farging. Prosentandelen av celler som viser Ki-67 nukleær farging ble redusert i et lignende mønster av Se alene (
P
0,05) og kombinasjonen diett (
P
0,01), grønn te alene påvirket ikke celleproliferasjon (figur 2B og 2D), med et lavt nivå av Ki-67 farging i AOM-ubehandlede normale krypter (figur 2A). Vi sammenlignet også flekker mønster av COX-2 mellom AOM-ubehandlet normale krypter og AOM-behandlede normale-vises krypter. AOM ubehandlede rotter viste en lav grad av cytoplasmatisk farging for COX-2 i tykktarmen (figur 2A), mens AOM-behandlede rotter viste økt farging av COX-2 (Figur 2B). Vi fant ut at alle tre dietter betydelig hemmet COX-2 cytoplasma farging (
P
0,05), sammenlignet med kontroll, var det ingen signifikant forskjell mellom eksperiment dietter (figur 2B og 2D)
.
En representativ del av immunhistokjemisk farging av β-catenin, Ki-67and COX-2 i AOM-ubehandlede normale krypter (A), AOM-behandlet normal-vises krypter fra kontroll, grønn te, Se og kombinasjonen diett (B ); -merkeindeksen for β-catenin (membran og nukleære positive celler, beregnet som antall positive celler pr krypten kolonne dividert med det totale antall celler og multiplisert med 100 (n = 12) (C); merking indeks for COX-2 og Ki-67 (n = 12) (D). β-catenin og Ki-67 nukleær farging ble signifikant redusert ved en kombinasjon diett og Se alene, men ikke grønn te. COX-2 cytoplasmatisk farging ble signifikant redusert med grønn te, SE . og kombinasjonen diett statistisk signifikans av kosttilskudd intervensjon mellom gruppene ble analysert ved ANOVA, verdier med forskjellige superscripts i hver kolonne var statistisk forskjellig (
P
0,05), Barer:. gjennomsnitt ± SEM
neste forhold fargingsmønsteret for β-catenin mellom AOM-behandlet normal-vises krypter og AOM-induserte svulster. økt ß-catenin flekker, særlig sterkere kjernefysiske farging var vesentlig høyere i colontumorer enn i normal -appearing krypter i samsvar med translokasjon av ß-catenin (figur 3B). Ingen av betydelig påvirket membranfarging for β-catenin i normale-vises krypter fra svulsten studien, men Se diett alene dietter (
P 0,05
) og kombinasjonen diett (
P 0,01
) viste konsistente hemmende effekt på β-catenin atom akkumulering (figur 3C). Effekten av kosttilskudd intervensjon på β-catenin uttrykk ble videre støttet av western blot analyse, som viser total β-catenin var betydelig lavere i normal-vises krypter av rotter matet kombinasjonen diett eller Se alene (Figur 3E og 3F).
En representativ del av immunhistokjemisk farging β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 i AOM-ubehandlede normale krypter (A), AOM-behandlet normal-vises krypter fra kontrollpanelet, grønn te, Se og kombinasjonen diett (B) og svulster; -merkeindeksen for β-catenin (membran og nukleære positive celler) (n = 12) (C) og merking indeks for DNMT1 og Ac-H3 (n = 12) (D). Western blot-analyse av β-catenin, DNMT1 og Ac-H3 for kolon prøver (n = 6) (E), ekspresjon av β-catenin og DNMT1 ble normalisert til den av β-aktin og ekspresjon av Ac-H3 ble normalisert til den av H3, ble dataene presentert som precent av kontroll (F). Økt sterk β-catenin nukleær farging og DNMT1 overekspresjon ble vist i AOM-indusert svulster, mens svakere Ac-H3 uttrykk ble notert i colontumorer. β-catenin atom farging ble betydelig redusert ved en kombinasjon diett og Se alene, men ikke grønn te; DNMT1 ble signifikant redusert ved en kombinasjon diett og grønn te alene, men ikke Se; Ac-H3 nukleær farging ble signifikant øket ved kombinasjonen diett og Se alene, men ikke grønn te. Statistisk signifikans av kosttilskudd intervensjon mellom gruppene ble analysert ved ANOVA, verdier med forskjellige superscripts i hver kolonne var statistisk forskjellig (
P
0,05), Barer:. Gjennomsnitt ± SEM
kombinasjonen dietten hemmer DNMT1 uttrykk og økt histon H3 acetylering
DNA metyltransferaser DNMT og histonmodifikasjonene spiller viktige roller i DNA metylering, med overekspresjon av DNMT1 og deacetylering av histon H3 eller H4 rapportert i tykktarm kreft [33]. Med dette i bakhodet vi undersøkte fargemønster av DNMT1 og Ac-H3 i AOM-indusert colontumorer, sammenlignet med AOM-ubehandlet normale krypter samt FDV-behandlede normale-vises krypter. Sterk kjernekraft farging av DNMT1 og mindre intens atom farging av Ac-H3 ble registrert i AOM-induserte tumorer (figur 3B); i forhold til normal krypten (figur 3A) og normal-vises krypter (Figur 3B), hvor DNMT1 og AC-H3 positive celler ble hovedsakelig plassert i proliferativ rommet (figur 3B).
For å avgjøre om DNMT1 og Ac- H3 i normal-vises krypter ble regulert til SE alene, grønn te alene og kombinasjonen dietter, vi målte prosentandelen av DNMT1 og Ac-H3-positive celler for de 4 diettgrupper (Figur 3D). Signifikant inhibering av DNMT1 ble observert i rotter foret med kombinasjonen diett og grønn te alene,
P
0,05 versus kontroll, mens SE alene hadde ingen signifikant effekt på DNMT1 uttrykk. Når man sammenligner Ac-H3 mellom diettgruppene, ble sterkest induksjon av Ac-H3 hos rotter fôret kombinasjonen kosthold, Se alene også betydelig økt Ac-H3,
P
0,05, sammenlignet med kontroll kosthold , men grønn te alene ikke hadde noen effekt (figur 3D).
