Abstract
Det er allment akseptert at de fleste kolorektal kreft (CRC) oppstår fra kolorektal adenom (CRA) , men transcriptomic data som karakteriserer utviklingen av kolorektal normal slimhinne til adenom, og deretter til adenokarsinom er knappe. Disse overgangs trinnene ble undersøkt ved anvendelse av mikromatriser, både ved nivået av genekspresjon og alternative pre-mRNA-spleising. Mange gener og eksoner ble unormalt uttrykt i CRA, enda mer enn i CRC, sammenlignet med normale slimhinner. Kjente biologiske mekanismer som er involvert i CRC ble endret i CRA, men flere nye beriket veier ble også gjenkjent, slik som komplement og koagulasjon kaskader. Vi har også identifisert fire interseksjonell transkripsjons signaturer som kan skille CRA fra normal slimhinner eller CRC, inkludert en signatur av 40 gener differensielt deregulerte både CRA og CRC prøver. Et flertall av disse genene hadde blitt beskrevet i forskjellige krefttyper, inkludert
FBLN1
eller
INHBA
, men bare et fåtall i CRC. Flere av disse forandringer ble også observert på proteinnivå. I tillegg 20% av disse genene (
dvs. CFH
,
CRYAB
,
DPT
,
FBLN1
,
ITIH5
,
NR3C2
,
SLIT3 Hotell og
TIMP1
) viste endret pre-mRNA spleising i CRA. Som en global variasjon som forekommer siden CRA scenen, og vedlikeholdes i CRC, kan uttrykket og skjøte endringer av denne 40-genet sett markere risikoen for kreft forekomst fra analyse av CRA biopsier
Citation. Pesson M, Volant A, Uguen A, Trillet K, De La Grange P, Aubry M, et al. (2014) En Gene Expression og Pre-mRNA skjøting Signatur som markerer Adenom-Adenocarcinoma Progresjon i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (2): e87761. doi: 10,1371 /journal.pone.0087761
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 24 september 2013; Godkjent: 30 desember 2013; Publisert: 06.02.2014
Copyright: © 2014 Pesson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finansiert av Inserm, Brest University, Brest Universitetssykehus Cancéropole av Grand Ouest, Ligue contre le Cancer, OSEO – BioIntelligence Program, ARC, og Bretagne-regionen. MP var mottakeren av et fellesskap fra regionen Bretagne. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de mest utbredte kreftformer i utviklede land, og er en viktig ledende årsak til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Den vanligste typen av CRC er adenokarsinom ( 95%), som er en invasiv svulst i kjertel epitel i tykktarmen eller endetarmen. Det er akseptert at adenokarsinomer kan trolig oppstå fra kolorektal adenom (Cras), som utledes fra bestemte fenotypiske egenskaper, for eksempel størrelse og histologi.
Kolorektal lesjoner er klassifisert til endoskopi som ikke-polypoid (flat) og polypoid, som er delt inn i rør, tubulovillous eller villøse, med ulike grader av dysplasi. CRA blir ofte referert til som adenomatøse polypper som representerer de lesjoner som oftest assosiert med neoplastiske utfall, og det ble vist at deres fjerning var knyttet til en reduksjon i forekomsten av CRC [1]. Mens rørformede adenomer er den mest vanlige, villous adenomer er minst hyppig, men de kan forvandle seg til kreft med høy frekvens [2]. I tillegg har pasienter med tidligere multiple polypper hadde adenomer med avanserte patologiske funksjoner [3].
Flere driver mutasjoner har blitt identifisert i løpet av progresjon fra CRA til CRC [4], sammen med andre molekylære hendelser, for eksempel mikroRNA modulasjon [5] eller pre-mRNA-spleisende endringer [6]. I tillegg har flere genekspresjonsprofiler blitt rapportert i CRC [7], [8]. Noen studier har også undersøkt genuttrykk i CRA og analysert avstamning med CRC [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ikke desto mindre var de fleste analyser utføres fra et begrenset antall av CRA prøver. Dessuten er det kun noen få studier sett på genom-wide alternative forhånds mRNA spleising profiler av CRA prøver [15] og deres kobling med CRC, selv om alternativ spleising skjer for anslagsvis 90% av gener i det menneskelige genom [16] sikret Hensikten med denne studien var å analysere, med mikromatriser, genekspresjon og alternativ spleising i CRA, sammenlignet med normal slimhinner, men også med CRC. Vi rapporterer her et helhetlig bilde av endringene som skjedde i CRA, noen som var spesifikke for CRA, mens andre ble delt i CRC. Viktigere, identifiserte vi en 40-gen set (32 ned- og 8 oppregulert gener), fra en interseksjonell analyse av side-by-side-sammenligninger, vurderer normal slimhinner, CRA og CRC, som kan markere de viktigste regulatoriske hendelser som preger trinnvis progresjon i tykk- og endetarmskreft.
Materialer og metoder
Tissue prøvebehandling
En skriftlig informert samtykkeskjema ble utarbeidet sammen med etikkomiteen av Brest universitetssykehus (ledet av Pr . JM Boles). Pasienter signert skjemaet, som ble returnert til anatomi og patologi avdeling Brest Universitetssykehus. Derfor ble denne studien godkjent av etikkomiteen av Brest Universitetssykehus. Kolorektalcancer biopsiprøver ble tatt etter kirurgisk fjerning. Prøvene ble deretter behandlet anonymt. Vevet fragmenter som stammer fra biopsier ble lagret i RNAlater (Ambion, Frankrike): 55 CRA, 25 CRC og 27 kolorektal normal slimhinne (NOR, paret med CRA eller CRC) ble samlet mellom 2006 og 2012, de fleste som i 2009. Fra CRA eller CRC biopsier, en overflate-fragment ble oppsamlet fra tumor-regionen, som omfatter i gjennomsnitt 90% tumorceller, 5% lymfocytter og 5% stromale celler. Disse prosentene var veldig homogen mellom uavhengige utvalg. Tre undergrupper (A1, A2 og A3) av CRA kunne skjelnes i henhold til histologiske data. Detaljert pasientopplysninger er presentert i tabell 1 og tabell S1. DNA og total RNA ble ekstrahert med AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) fra homogeniserte vevsprøver (20 mg), i henhold til produsentens instruksjoner. RNA renhet og integritet ble bestemt ved å måle den optiske tetthet forholdet (A260 /A280), og RNA integritet nummer (RIN) ble oppnådd ved bruk av RNA 6000 Nano LabChip (Agilent, Massy, Frankrike) og 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bare RNA prøver med en 28S /18S ratio 1,0 og RIN ≥7.0 ble brukt for microarray analyse
Hel-Genome Microarray
En analyse av 55 RNA prøver avledet fra kolorektal. vev, bestående av tre utvalgsgrupper (NOR, CRA og CRC) med varierende antall biologiske replikater, ble utført på 44k hele menneskelige genom mikromatriser (Agilent) som inneholder 41,093 sonder, som gir full dekning av menneskelige karakterutskrifter. Dobbelt cDNA ble syntetisert fra 500 ng av total RNA ved hjelp av hurtig Amp Merking kit, One-farge, som beskrevet av produsenten (Agilent). Merking med cyanine3-CTP, fragmentering av Sort, hybridisering og vasking ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Agilent). De mikromatriser ble skannet, og dataene ble ekstrahert med Agilent Feature Extraction Software.
Gene Expression Analysis
Raw genuttrykk data ble importert til GeneSpring GX 11.0.2 program (Agilent). Side-by-side-sammenligninger ble utført for genuttrykk endringer: CRC
vs
paret NOR, CRA
vs
NOR, og CRC
vs
CRA…. Gener med manglende verdier i mer enn 25% av prøvene ble ekskludert fra analysen. Disse dataene har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien deponeringsnummer GSE50114, GSE50115 og GSE50117. En to-fold cut-off forskjell ble brukt for å velge opp- og ned-regulerte gener (P-verdi ≤0.01 av
t
-test med Benjamini-Hochberg falske funnrate, FDR). Hierarkisk clustering av uttrykket data ble utført ved hjelp av euklidsk avstand med gjennomsnittlig kobling.
Gene Set Enrichment Analyse
Den offentlig tilgjengelig programvare, Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery [17], ble brukt for å analysere genet satt anrikning i kolorektale lesjoner. En to-fold cut-off forskjell ble brukt for å velge listen over deregulerte gener (P-verdi ≤0.01 av
t
-test med FDR). Bare trasé fra Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) vil bli beskrevet [18].
alternativ spleising Analyse
En samlet RNA, analysert i duplikat, fra tre kolorektal normal slimhinner og 24 CRA RNA prøver ble analysert on human exon 1,0 ST arrays (Affymetrix, Paris, Frankrike), som gjorde analyse av både genekspresjon og alternativ spleising. Microarray hybridisering ble utført ved Curie Institute anlegget (Paris, Frankrike). Rådata ble analysert ved GenoSplice teknologi. Disse dataene er tilgjengelige gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE50592. En 1,5 ganger cut-off forskjell ble brukt for å velge opp- og ned-regulerte gener og eksoner (P-verdi ≤ 0,05).
Real-Time Polymerase Chain Reaction Validering
Som en valideringstrinnet av microarray resultater, ble kvantitativ RT-PCR utført på tre grupper (NOR, CRA og CRC) på minst 8 prøver, inkludert noen av prøvene hybridiserte med mikromatriser, eller på et uavhengig sett av 14 CRA og 8 sammenkoblet tumor -Normal CRC prøver. Total RNA (200 ng) ble brukt for første tråd cDNA syntese med High-Capacity cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems). Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av strøm SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner med en ABI 7000 eller 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems). Alle bestemmelser ble utført i duplikat og normalisert mot
beta
-2-mikroglobulin som en intern kontroll-genet. Resultatene ble uttrykt som den relative genekspresjonen ved bruk av ΔΔCt metoden [19]. Alle de testede genene ble valgt basert på mikromatriseanalyser, for å validere den biologiske sti berikelse og et gen signatur i CRA og CRC. Primersekvensene og reaksjonsbetingelser vil bli gitt på forespørsel. I tillegg ble en PCR rekke oppsett (Qiagen) som brukes til å analysere, i NOR og CRC prøver, uttrykket av gener med primere til stede blant PCR matrisemultibrønnplater (apoptose, Cancer Pathway Finder, Drug Metabolism, Lipoprotein signalering og kolesterol stoffskiftet,
Wnt
signalveien).
Resultater
Sammenligning av tykktarms adenom Morfologiske Undergrupper
Flere mutasjonslandemerker har blitt beskrevet i progresjon til tykktarmskreft, slik som
KRAS
,
BRAF Hotell og
PI3K
mutasjoner [4], [20], og ble analysert i våre prøver (saksdokumenter). I tillegg ble mikro ustabilitet status (saksdokumenter) bestemt i 12 CRA prøver, men alle var negative. Wien klassifisering tillates å gruppere adenomer i to klasser: en mindre gruppe av lavere grad (3) med 11 (22%) prøver og en stor gruppe av 40 (78%) prøver av høyere kvalitet ( 3) (tabell S1) . Denne klassifiseringen samsvarte ikke med rør /villous /tubulovillous lesjonstyper, siden CRA med både lav karakter og høy grad av dysplasi ble jevnt fordelt i de tubullovillous og rørformede grupper (bare en CRA var fra villøse type). Dette skillet i rørformet, villøse eller tubulovillous ble derfor ikke vedtatt. Vi bestemte oss for å stole på en presis morfologi analyse og anvendt en anatomisk gruppering, noe som førte til forskjellsbehandling av tre morfologiske undergrupper: adenomer med områder av mikro-invasiv adenokarsinomer (A1; 10 prøver), utartet adenomer,
dvs.
. adenomer med områder av
i situ plakater (intra-slimhinnen) adenokarsinomer (A2; 17 prøver), og adenomer med områder av dysplasi (A3, 24 prøver). For å avgjøre om CRA kan også være preget av molekylære midler, ble en enveis ANOVA utført for å sammenligne CRA undergrupper til CRC og NOR-grupper, med «vevstype» som en ANOVA faktor (data ikke vist). Analysen viste at CRA undergrupper var meget tett med hverandre. Det var ingen forskjell mellom undergrupper A2 og A3, og maksimalt antall deregulerte prober ble funnet for undergruppen A1
vs
. undergruppe A2 sammenligning (49 sonder, tilsvarende 0,12% av det totale antall sonder, p-verdi ≤0.01). Videre, mens de sammenligninger mellom CRA undergrupper og normale slimhinner viste det største antall karakteristiske prober (opp til 4,382 sonder i undergruppe A2
vs
. NOR), sammenligninger mellom CRA undergrupper og CRC viste den minste (opp til 1.424 sonder i CRC
vs
. undergruppe A2). CRA som helhet var dermed mer forskjellig fra normale slimhinner enn fra CRC. De tre CRA undergruppene ble også sammenlignet med hverandre, og ingen forskjell ble observert i side-ved-side-sammenligning (P-verdi på ≤0.01 ved
t
-test med FDR). Derfor ble CRA vurderes samlet som én gruppe for ytterligere side-by-side-sammenligninger av Student
t
-test.
Gene Expression Profilering i Colorectal lesjoner i sammenligning med normal slimhinner
for å identifisere gener som kunne delta i utviklingen fra normal slimhinne til CRA, utførte vi en CRA
vs
. NOR sammenligning, og fant ut at 2,393 prober ble deregulert i CRA (≥2.0 fold-endring (FC), P-verdi på ≤0.01 av
t
-test med FDR), tilsvarende 32% opp- og 68 % ned-regelverket. Barnekonvensjonen
vs
. NOR sammenligning viste at 1.805 prober ble deregulert i CRC (≥2.0 FC, P-verdi ≤0.01 av paret
t
-test med FDR), tilsvarende 46% opp- og 54% ned-regelverket. Varme kart over de deregulerte prober med en fold-endring ≥3.0 og en P-verdi ≤0.001 er vist i figur 1A (CRA
vs
. NOR) og 1B (CRC
vs
. NOR), og figur S1 (CRA
vs
. NOR, hele bildet). Komplette lister over de forskjellig uttrykt sonder i CRA
vs
. NOR og CRC
vs
. NOR er presentert i tabell S2 og S3, respektivt. Et sett med deregulering hendelser i CRA
vs
. NOR ble analysert ved kvantitativ RT-PCR, og validering frekvensen av Agilent microarray resultater var 78% (50 av 64 transkripsjoner, tabell S4). I tillegg ble Qiagen PCR array-eksperimenter utført på et uavhengig sett med 96 CRC og 20 NOR prøver (fra Brest svulst bank). Blant de deregulerte sonder i CRC
vs
. NOR på mikromatriser, 41 primerpar som svarer til de samme genene som var til stede i PCR-matriser. Tjueåtte ble også deregulert i PCR arrays (≥2.0 FC, P-verdi ≤0.01), tilsvarende 68% kryssvalidering (tabell S5).
Heat kart over uttrykket data ble bygget ved hjelp av euklidsk avstand med gjennomsnittlig kobling. Varmen kart over deregulerte prober med en fold-endring ≥3.0 og en P-verdi ≤0.001 vises for CRA
vs
. NOR (A, komplett varme kartet i figur S1), for CRC
vs
. NOR (B), og CRC
vs
. CRA (C).
CRA
vs
. NOR sammenligning viste flere forskjeller enn CRC
vs
. NOR sammenligning, og det var mer down-regelverket (68% i CRA
vs
. 54% i CRC) enn up-regelverket (32% i CRA
vs
. 46% i CRC) . Et tverrgående analyse av probe-nivåendringer ble utført (figur 2A), som viser en signatur av 954 prober deregulerte i begge CRA og CRC prøvene sammenlignet med normale slimhinner (tabell S6 og fig S2), tilsvarende 40% og 53% deregulert sonder CRA og CRC, henholdsvis. Alle vanlige deregulerte probene fulgte den samme type av variasjon i begge sammenligninger,
dvs.
Ble opp- eller ned-regulert på lignende måte.
et tverrgående analyse av sonde nivå endringer ble utført. Cut-off verdiene var P-verdi ≤0.01 og fold-endring ≥2. CRA
vs
. NOR sammenligning viste det største antall probe endringer nivå (2,393 deregulerte prober), mens CRC
vs
. CRA sammenligning viste de laveste (669 deregulerte prober). Sondene som viste endringer i to eller tre sammenligninger var av interesse. (A) Underskrift av 954 prober deregulerte både CRA og CRC lesjoner i forhold til NOR. (B) Underskrift av 172 prober deregulerte i CRC i forhold til både CRA og NOR. (C) Underskrift av 265 prober deregulerte i CRC i forhold til CRA, som nivåene var allerede unormal i CRA i forhold til NOR. (D) Underskrift av 44 sonder som viser endringer i de tre sammenligninger (CRA
vs
. NOR, CRC
vs
. CRA og CRC
vs
. NOR). Forkortelser: NOR: kolorektal normal slimhinne; CRA: kolorektal adenom; CRC. Kolorektalkreft
Pathway berikelse i Kolorektal lesjoner i sammenligning med normal slimhinner
KEGG pathway analyse viste 25 gensettene skille CRA fra NOR, og 20 skille CRC fra NOR ( P-verdi ≤0.05, tabell 2), vurderer deregulerte prober med en to-fold cut-off (P-verdi ≤0.01 av
t
-test med FDR). Komplement og koagulasjon kaskader, cytokin-cytokin reseptor interaksjon, og chemokin signalveier var blant toppen av anrikede trasé i CRA
vs
. NOR, mens cellesyklus og DNA replikasjon var trasé som er mest berørt i CRC
vs
. NOR, i henhold til P-verdi. Syv trasé ble beriket både CRA
vs
. NOR og CRC
vs
. NOR-sammenligninger, hvorav de p53 signalveien var en del av som allerede er beskrevet anrikede baner i CRA [14]. Nitrogen metabolisme var også en vanlig beriket gangsti mellom begge analysene, og inkluderte karbon anhydrases (
CA1 Hotell og
CA4
) som var en del av de mest nedregulert sonder i CRA og CRC.
Hvis en 1,1-fold cut-off forskjell i stedet for 2.0 ble brukt for å velge deregulerte sonder (P-verdi ≤0.01),
dvs.
. hvis alle deregulerte prober ble ansett (5 733 prober), setter 18-genet i stedet for 25 ble endret i CRA
vs
. NOR ifølge KEGG (P-verdi ≤0.05; Tabell S7). Bare komplement og koagulasjon kaskader veien var felles mellom både 18 og 25 genet lister. Derfor ble 17 nye veier beriket i CRA, for eksempel DNA replikasjon, cellesyklus, spliceosome eller mismatch reparasjon.
Gene Expression Profilering i Colorectal adenokarsinomer i Sammenligning med tykktarms Adenomer
En analyse av forskjellig oppdaget sonder mellom CRC og CRA identifisert 669 deregulerte prober (≥2.0 FC, P-verdi på ≤0.01 av
t
-test med FDR), tilsvarende 55% opp- og 45% ned-regelverket. Varmen kart over deregulerte prober med en fold-endring ≥3.0 og en P-verdi ≤0.001 er vist i figur 1C. Den fullstendige listen over de differensial sondesignaler i CRC
vs
. CRA er presentert i tabell S8. Barnekonvensjonen
vs
. CRA sammenligning viste færre sonde nivåforskjeller med mye lavere fold-endringer enn CRC
vs
. NOR og CRA
vs
. NOR sammenligninger. Skjærings analyse av sondesignaler viste en signatur av 172 prober deregulerte i CRC sammenlignet med både CRA og NOR-prøver (figur 2B, tabell S9 og fig S3), tilsvarende 26% deregulerte prober i CRC
vs
. CRA, og mindre enn 10% deregulerte sonder i CRC
vs
. ELLER. Som disse endringene ikke var til stede i CRA, kan de være markører for CRC aggressivitet.
Pathway berikelse i Colorectal adenokarsinomer i Sammenligning med tykktarms Adenomer
KEGG pathway Analysen avdekket fem gensettene skille CRC fra CRA (P-verdi ≤0.05, tabell 2), vurderer deregulert prober med en to-fold cut-off (P-verdi ≤0.01 av
t
-test med FDR). To beriket trasé var spesifikke for CRC
vs
. CRA sammenligning: arginin og prolin metabolisme, og TGF
beta
signalveien som allerede har blitt beskrevet som en endret sti mellom CRA og CRC [9]. Videre CRA
vs
. NOR og CRC
vs
. CRA sammenligninger hadde tre vanlige beriket veier, blant annet fokus heft og ECM-reseptor interaksjon var en del av allerede rapportert trasé beriket i kolon kreftutvikling [21]. Disse banene kunne spille en viktig rolle i utviklingen av CRC, fordi de ble beriket fra NOR til CRA, og deretter fra CRA til CRC.
Intermediate underskrift progresjon fra tykktarms Adenom til tykktarms Adenocarcinoma
bevisene for progresjon fra NOR til CRA, og deretter til CRC, ble undersøkt med en interseksjonell analyse av sonde nivå endringer. En signatur av 265 sonder, tilsvarende 215-genene, ble identifisert (figur 2C, Tabell S10 og fig S4), som var tilfeldig i lister over 2,393 og 669 deregulerte prober, som svarer til den CRA
vs
. NOR og CRC
vs
. CRA sammenligninger, henholdsvis. Det omfattet deregulerte sonder i CRC
vs
. CRA, som allerede var tydelig i CRA
vs
. NOR analyse. Fordelinger av opp- og ned-regulert hendelser i CRC
vs
. CRA var 69% og 31%, henholdsvis. En berikelse analyse av signaturen til 265 prober ble utført ved hjelp KEGG trasé, og avslørte at 41 gener var en del av åtte beriket gensettene, inkludert brennvidde heft, ECM-reseptor interaksjon eller TGF
beta
signalveien (tabell S11). Dessuten ble et mellomliggende genekspresjon signatur av 44 sonder (tilsvarende 40-gener) er identifisert (figur 2D og Tabell 3), som var tilfeldig i de tre lister av deregulerte prober, og deretter ble en del av alle signaturer som vi tidligere beskrevet (signaturer fra 954, 172 og 265 prober). Det tilsvarte 8 oppover- og 32 nedregulert gener i begge CRA og CRC prøver, sammenlignet med normale slimhinner. Åtte sonder demonstrert gradvis økt signaler fra NOR til CRA, og deretter til CRC; 23 prober avslørt gradvis redusert signaler. I tillegg ble 13 prober mindre trykt i CRC enn i CRA, sammenlignet med NOR.
Klassifisering av tykktarms Adenomer i sammenligning med normal slimhinner og tykktarms adenokarsinomer
En klassifisering av kolorektale vev ble utført ved bruk av hierarkisk gruppering av sondesignal forandringer som svarer til de fire signaturer som tidligere er beskrevet. Bare to gruppene ble preget vurderer signaturen av 954 prober (figur S2): ett var sammensatt av normale slimhinner og den andre inneholdt en blanding av kolorektal lesjoner. I motsetning til den gruppering med tanke på signaturen til 172 prober lov til å skille de tre typer av kolorektal vev (Figur S3): en gruppe ble bare består av CRC, og de andre ble delt opp i en cra undergruppe og en NOR-undergruppen. Tilsvarende clustering med signaturen av 265 prober aktivert for å skille de tre prøvetyper (fig S4), men en gruppe ble bare sammensatt av CRA, og den andre gruppert sammen NOR og CRC-prøvene som ble distribuert i to forskjellige undergrupper. Endelig signaturen til 44 sonder viste at flertallet av CRA gruppert med CRC, noen CRA (viser minst berørt histologi) blir gruppert med NOR prøver (figur 3). For de fleste av prøvene ble det ikke strengt samsvar mellom histologiske (morfologiske undergrupper eller lokalisering) og molekylære data anerkjent om fordelingen av CRA inn i undergrupper. Tilsvarende spesifikk av CRC clustering ble ikke forklart av tumorlokalisasjon (tabell S1). Molekylære data kan dermed gi utfyllende informasjon til å klassifisere kolorektal lesjoner.
Grener representerer individuelle kolorektal prøver. Ulike farger ble brukt til å identifisere prøven grupper: rød, gruppe av normal slimhinne (N: normal); grønt, gruppe av adenomer (A: adenom); blå, gruppe av adenokarsinomer (C: kreft). Den første prøven merknad tilsvarer prøven gruppen. De undergrupper av adenomer er spesifisert: A1, adenomer med områder av mikro-invasiv adenokarsinomer; A2, adenomer med områder av intra-slimhinnen adenokarsinomer; A3, adenomer med områder med dysplasi. Den andre prøven merknad tilsvarer prøvenummer.
Exon-nivå analyse i Colorectal Adenomer
En CRA
vs
. NOR sammenligning ble utført på menneskelig Exon 1,0 ST arrays (Affymetrix), og viste at 1,484 gener ble deregulert i CRA (590 opp- og 894 nedregulert gener, ≥1.5 FC, P-verdi ≤0.05; Tabell S12). En tilsvarende varme kart er vist i Figur S5. Et sett med deregulerte transkripsjoner i CRA
vs
. NOR ble analysert ved kvantitativ RT-PCR, og validering frekvensen av Affymetrix microarray resultater var 83% (24 av 29 transkripsjoner, også validerte for Agilent analyse). I tillegg CRA
vs
. NOR sammenligning viste omfattende endringer i alternativ spleising profiler: 1,852 eksoner ble deregulert i CRA (862 opp- og 990 nedregulert eksoner, ≥1.5 FC, P-verdi ≤0.05; tabell S13). En offentlig tilgjengelig microarray uttrykk datasett fra 10 paret tumor normal CRC prøver [6] ble lastet ned fra Affymetrix eget websted for å sammenligne alternativ spleising profilering i CRA og CRC. CRA
vs
. NOR og CRC
vs
. NOR sammenligninger hadde 100 deregulerte eksoner felles. Mens 47 oppover- og 47 nedregulert spleisehendelser fulgte den samme type av variasjon i de to sammenligninger, noen reguleringer var motsatt i CRA og CRC, svarende til 6% av vanlige deregulerte eksoner (data ikke vist). Vi fant ut at 296 deregulert (102 opp- og 194 nedregulert) sonder i CRA
vs
. NOR fra Agilent analysen viste deregulerte eksoner i Affymetrix analyse (data ikke vist). Mange gener som var en del av endrede trasé hadde deregulerte eksoner. Blant de 40 genene i Agilent transkripsjonen signaturen til 44 sonder, 8 (
CFH
,
CRYAB
,
DPT
,
FBLN1
,
ITIH5
,
NR3C2
,
SLIT3 Hotell og
TIMP1
),
dvs.
. 20% hadde deregulerte eksoner (tabell S14).
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å undersøke, på hel-transkriptomet nivå, omfanget av variasjoner som forekommer i menneske kolorektale adenomer i forhold til adenokarsinomer, tar normal epitel som en referanse. Mange endringer var tydelig i CRA
vs
. NOR, enda mer enn i CRC
vs
. ELLER. Derfor CRA, som en type mellomledd lesjon, allerede viste tydelige tegn på forandringer. Fra de molekylære forandringer dokumentert i CRA, er det klart at CRA ikke bare akkumulerende endringer som alle vil bli funnet i CRC. Eventuelt utviklingen til CRC følger en mer strengt klonal ekspansjon, noe som kan føre til seleksjon av genet endringer viktige for klonal vekst mens eliminere mindre relevante modifikasjoner. Ifølge denne hypotesen, kan CRA ha ulike utfall, noen utvikler seg til kreft, mens andre kan være utsatt for forsvinningen. Vi identifiserte fire signaturer skille typer kolorektal vev, og viste at en 40-genet sett kan være av spesiell interesse, for å markere de molekylære endringer som skiller normal slimhinne fra CRA og CRC. Viktigere, flere alternative pre-mRNA spleising hendelsene var også karakteristisk for CRA til CRC progresjon.
Flere gener involvert i CRC ble deregulert i CRA
vs
. ELLER. Den største økningen i sonde nivåer inkludert
KIA1199 Hotell som allerede hadde blitt funnet deregulert i CRA [22], eller matriksmetalloproteinase
MMP7
som over-uttrykk er kjent for å påvirke tidlig kolorektal kreftutvikling [23 ]. Femten genet sett, for eksempel de som er involvert i cytokin-cytokin reseptor interaksjon, chemokine signalveien, eller celleadhesjonsmolekyler, var spesifikke for CRA
vs
. ELLER. Viktigere, ble flere nye beriket biologiske pathways identifisert, blant som komplement og koagulasjon kaskader veien var den mest betydelig påvirket i Agilent analyse, og ble også identifisert som endret i Affymetrix analyse (data ikke vist). Dette stemmer med en fersk rapport tyder på at komponenter fra koagulasjonskaskaden kunne påvirke kreft progresjon [24].
En rekke gener ble også uttrykt forskjellig i CRC
vs
. CRA. De fleste av disse genene er ikke blitt beskrevet i tidligere mikromatrise undersøkelser, selv om flere av endringene enige til tidligere rapporter, herunder variasjoner i ekspresjonsnivåer av AMN, THBS2, SPP1 eller TIMP1 [25], [26], [27]. I tillegg 58 sonder (19 oppover- og 39 nedregulert) fra CRC
vs
. CRA sammenligning var blant en liste over 248 prober tidligere identifisert [11], blant annet at for
AURKA
, som koder for et cellesyklus-regulert kinase involvert i CRC [28], og ble over-uttrykt i CRC, som sammenlignet med CRA og NOR. I tillegg blant våre topp deregulert sonder,
SPON2
,
RGS16
,
SFRP4 Hotell og
CTHRC1
har allerede blitt funnet blant de mest oppregulert sonder i CRC i forhold til CRA, og
FAM55D
,
ATOH8
,
RETNLB
,
ID4
,
UGT1A6
, og
VSIG2
, blant de mest nedregulert sonder [11]. Det ble allerede vist at noen av disse genene ble deregulert i epiteliale kreftformer eller assosiert med, for eksempel
SFRP4
,
SPON2 product: [29],
RGS16 product: [30], eller
UGT1A6 product: [31].
Spesifikke genuttrykk endringer i enten type colorectal lesjoner ble identifisert, takket være interseksjonell analyse (figur 2). For det første, 1,218 (51%) deregulerte prober var spesifikke for NOR til CRA overgang, og deretter kunne markere lav risiko CRA, fordi det ikke var noen kobling med CRC. Dernest, 723 (40%) deregulerte prober var spesifikke for CRC
vs
. NOR, og da kunne merke spesielt CRC. Til slutt, 276 (41%) deregulerte prober var spesifikke for cra til CRC overgang. Sistnevnte probe sett kunne være interessant å definere hendelser som er spesifikke for de siste trinnene av kreft progresjon.
signatur av 954 prober samsvarer med gener som viser uttrykk endringer i både CRA og CRC prøvene, sammenlignet med normal slimhinner. Som disse deregulerte sonder i CRC ble også unormalt uttrykt i CRA, de var usannsynlig kandidat markører for progresjon fra CRA til CRC. Følgelig fikk den hierarkiske clustering ikke tillate å skille CRA fra CRC. Signaturen til 172 sonder, tilsvarende gener deregulerte i CRC i forhold til både CRA og NOR, kunne markere spesielt CRC, og støtter denne hypotesen, den hierarkiske clustering identifisert CRC som en enkelt gruppe. Signaturen til 265 prober tilsvarende gener deregulerte i CRC
vs
. CRA, som allerede var unormalt uttrykt i CRA
vs
.
