Abstract
De endrede uttrykk for claudin proteiner har blitt rapportert i løpet av tumorigenesis av tykktarmskreft. Imidlertid er de molekylære mekanismene som regulerer disse hendelsene i denne krefttypen dårlig forstått. Her rapporterer vi at epidermal vekstfaktor (EGF) øker ekspresjonen av claudin-3 i human kolorektal adenokarsinom HT-29-celler. Denne økningen var relatert til økt cellemigrasjon og dannelse av forankringsavhengige og forankringsuavhengig kolonier. Vi viste videre at ERK1 /2 og PI3K-Akt trasé var involvert i reguleringen av disse effektene fordi spesifikk farmakologisk hemming blokkert disse hendelsene. Genetisk manipulering av claudin-1 og claudin-3 i HT-29-celler viste at overekspresjon av claudin-1 resulterte i redusert cellemigrering; Men migrasjonen ble ikke forandret i celler som overuttrykt claudin-3. Videre er overekspresjon av claudin-3, men ikke den av claudin-1, økte stramme koblingsmessige paracellulære forandring av makromolekyler. I tillegg ble det observert en økt dannelse av forankringsavhengig og forankrings selvstendige kolonier i celler som overuttrykt claudin-3, mens ble det ikke observert slike endringer når claudin-en ble overexpressed. Til slutt, claudin-3 stanse alene til tross indusere økning proliferasjon, og dannelse av anchoragedependent og-Uavhengig kolonier, var den i stand til å forhindre den EGF-induserte økning maligne potensial. Som konklusjon, viser våre resultater en ny rolle for claudin-3-overekspresjon i å fremme malignitetspotensiale kolorektale cancerceller, som potensielt kan reguleres av EGF-aktivert ERK1 /2 og PI3K-Akt trasé
Citation.: de Souza WF, Fortunato-Miranda N, Robbs BK, de Araujo WM, de-Freitas-Junior JC, Bastos LG, et al. (2013) claudin-3 Overuttrykte Øker malignitetspotensiale av kolorektal kreft celler: Roller av ERK1 /2 og PI3K-Akt som modulatorer av EGFR signalering. PLoS ONE 8 (9): e74994. doi: 10,1371 /journal.pone.0074994
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 03.01.2013; Godkjent: 09.08.2013; Publisert: 19.09.2013
Copyright: © 2013 de Souza et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble sponset av Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Norte (CNPq), Coordenação de Aperfeiçõamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Ministerio da Saúde – Brasil, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) og Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia em kreft (573806 /2008-0 og 170,026 /2008). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tett veikryss (TJs) er viktige strukturelle komponenter i apikale junctional kompleks i epitel, hvor de regulerer ulike intracellulære prosesser, slik som etablering av apikal-basal polaritet og flyten av stoffer over inter plass [1 ]. Claudins er de viktigste proteiner som regulerer funksjonene til TJs og er klassifisert som en familie på tetraspan integrerte membranproteiner, som i dag består av 27 medlemmer [2]. En myriade av sykdommer, inkludert kreft, har vært forbundet med endringer i ekspresjonen, stabilitet og subcellulære lokalisering av claudin familiemedlemmer [3], [4], [5], [6]. Men den presise molekylære mekanismene som regulerer ekspresjon og funksjon av disse proteiner, spesielt i kolorektal kreft, er dårlig forstått.
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er dimeriseres og aktivert ved dets ekstracellulære ligand, EGF, som utløser en signalkaskade som fører til aktivering av cytoplasmiske reaksjonsveier slik som MAPK og PI3K-Akt [7], [8]; disse banene er kjent for å modulere proliferasjon, differensiering og motstand mot celledød [9], [10]. Studier har vist at disse banene er involvert i hendelser relatert til de kreftfremkallende prosesser i mus epidermal og humane magecancerceller [11], [12], så vel som den økte vandrende og invasiv potensial under den epiteliale-mesenkymale overgang i human ovarian celler [13]. EGF-mediert signalveier er også kjent for å spille en viktig rolle i organiseringen av TJs, i hvilken de regulere ekspresjonen og lokalisering av claudin proteiner. For eksempel, ble EGF rapportert å indusere oppregulering av Claudins 1, 3 og 4, og den EGF-induserte nedregulering av claudin-2 øker styrken av den intercellulære barriere, som bestemt ved en øket transepitelial elektrisk motstand (TER) i MDCK- II celler [14], [15]. Men ved å bruke samme modell (MDCK celler), har andre forfattere rapportert at nedregulering av claudin-2 indusert høyere cellemotilitet, selv med økt TER [16]. Nylig EGFR /ERK /c-Fos veien ble vist å opp-regulere claudin-2, en økning som var korrelert med økt inter permeabilitet og cellemigrasjon i humane lunge adenokarcinomceller [17], [18].
lite informasjon er kjent om de molekylære mekanismene bak endringene i claudin uttrykk som er forbundet med kolorektal tumorigenesis. Vi har vist at pasienter med kolorektal kreft som presenteres økt ekspresjonsnivå av Claudins 1, 3 og 4, som endret barrierefunksjonen av TJS [19]. Nyere studier har rapportert en kontroversiell rolle for claudin-en i løpet av kolorektal kreftutvikling; økt claudin-en ekspresjon ble observert i levermetastatiske lesjoner av tykktarmskreft, men dette uttrykket ble redusert i de lymfeknutemetastaser av tykktarmskreft [20], [21]. I tillegg har de ERK1 /2 og PI3K veier blitt rapportert å formidle en økning i EGF-indusert claudin-2-ekspresjon i tykktarmskreftceller; denne hendelsen ble ledsaget av en økning i spredning, forankringsuavhengig vekst og tumorvekst
in vivo product: [22]. Derfor er det viktig å forstå de molekylære mekanismene som regulerer uttrykket av andre claudin familiemedlemmer og konsekvensene av claudin overekspresjon i kolorektal kreft progresjon.
I denne studien, viser vi at EGF-mediert økt uttrykk av claudin-3 er relatert til økt cellemigrering og dannelsen av forankringsavhengige og forankringsuavhengige kolonier i human kolorektal adenokarsinom HT-29-celler. Videre viser vi at disse hendelsene ble mediert av ERK1 /2 og PI3K-Akt veier. Vi demonstrerte også at de tvangs overekspresjon av claudin-3 i HT-29-celler ved genetisk manipulering økt maligne potensial, mens overekspresjon av claudin-en redusert cellemigrering. Viktigst, våre resultater viser at claudin-3 spiller en rolle som svulst promoter når uttrykket er ubalansert og implisere de ERK1 /2 og PI3K-Akt signalveier som modulatorer av claudin-3 oppregulering relaterte tumorprogresjon i kolorektal kreftceller.
Materialer og metoder
Material
anti-claudin-en (kat. nr. 51-9000) og anti-claudin-3 (kat. nr. 34-1700) kanin polyklonale antistoffer, så vel som et anti-α-tubulin mus monoklonalt antistoff (Kat. nr. 32-2500) ble oppnådd fra Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA, USA). Anti-Akt (Kat. Nr. 4691) og anti-p-Akt (Kat. Nr. 4058) kanin-monoklonale antistoffer, så vel som et anti-ERK musemonoklonalt (Kat. Nr. 9107) antistoff ble anskaffet fra Cell Signaling (Beverly , MA, USA). Den anti-uvomorulin /E-cadherin rotte monoklonalt (Kat. Nr. U3254) og anti-p-ERK1 /2 mus monoklonalt (Kat. Nr. M8159) antistoffer ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). En anti-E-cadherin mus monoklonalt antistoff (klon 36, kat. Nr. 610182) ble innkjøpt fra BD Biosciences (San Diego, CA, USA). Pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin og anti-mus IgG ble kjøpt fra GE Healthcare (Chalfont St. Giles, UK). Alex-fluor-488 anti-kanin (kat. Nr. A11008) og Alex-fluor-546 anti-rotte (kat. Nr. A11010) ble oppnådd fra Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). 2- (4-morfolinyl) -8-fenyl-1 (4H) -benzopyran-4-on LY294002 (PI3K-inhibitor) (Kat. Nr. L9908) ble erholdt fra Sigma-Aldrich, 2- (2-amino- 3-metoksyfenyl) -4H-1-benzopyran-4-on PD98059 (MEK1 inhibitor) (Kat. nr. 9900) ble erholdt fra Cell Signaling, og EGF (Kat. nr. PHG0311) ble innkjøpt fra Invitrogen Inc.
celle~~POS=TRUNC
human kolorektal adenokarsinom-cellelinjene Caco-2 (Kat. nr. HTB-37) og HT-29 (Kat. nr. HTB-38), så vel som humane embryonale
nyrecellelinje
HEK-293 (Kat. nr. CRL-1573) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Caco-2-celler til stede med en differensiert fenotype på monolaget trinnet og besitter en lav invasive og metastatiske potensiale [23], [24], [25], mens HT-29-celler til stede med en udifferensiert fenotype og en høy tumorigent potensiale [ ,,,0],26]. Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) som var supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), penicillin G (60 mg /L), og streptomycin (100 mg /l) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 /luft. For eksperimentelle formål ble cellene sådd ut på kulturskåler eller på dekkglass.
Behandling med EGF og farmakologiske inhibitorer
Cellekulturer ble behandlet med 20 ng /ml EGF, en konsentrasjon som vi har brukt i en tidligere studie [27]. Effektene av EGF behandling på claudin-1 og claudin-3 ekspresjon i Caco-2 og HT-29 celler ble vurdert i celler som vokser i DMEM-medium supplert med 10% FBS etter 6, 24 og 48 timer. For farmakologisk hemning, ble cellene sultet over natten serum og selektive inhibitorer ble tilsatt til cellekulturene 1 time før EGF behandling for å inhibere den indre kinase-aktivitet. Cellene ble deretter inkubert med frisk kulturmedium supplert med 10% FBS inneholdende EGF og selektive inhibitorer, som ble opprettholdt gjennom hele forsøket. Inhibitorene ble fortynnet i DMSO og lagret ved -20 ° C. Hver konsentrert løsning ble fortynnet umiddelbart før hvert forsøk for å gi sluttkonsentrasjoner på 50 mikrometer (PD98059) og 8 um (LY294002).
Plasmid Bygg, fremstilling av rekombinante Retrovirus og infeksjon av HT-29 Cells
konstruksjoner som inneholder claudin-en og claudin-3 murine cDNA har tidligere blitt beskrevet [28], [29] og ble vennlig levert av Dr. Mikio Furuse (Division of Cell Biology, Institutt for fysiologi og cellebiologi, Kobe universitet , Japan). CDNA i disse konstruksjonene ble subklonet inn i pBABE-Puro ryggrad retroviral plasmid å generere pBABE-Cld1 (BamH1-Xho1) og pBABE-Cld3 (Bgl2-Xho1) konstruksjoner. HEK-293-celler ble anvendt som retrovirale pakkingscellene etter en transient ko-transfeksjon av kalsiumfosfat utfelling i 24 timer med PCL-Ampho retroviral pakke vektor (Cat nr 10046P;.. IMGENEX, CA, USA) og en av de følgende konstruksjoner : pBABE-Cld1, pBABE-Cld3 eller tomme retrovirale vektorer. Den cellefrie supernatant, som inneholdt viruset ble samlet 48 timer etter transfeksjon, blandet 1:01 med friskt medium, supplert med 8 ug /ml polybrene (Cat nr 107689;.. Sigma-Aldrich), og straks anvendt for utskillelsen infeksjon (2 x 45 min ved 400 x g ved romtemperatur) av 5 x 10
4 HT-29-celler. Infiserte celler ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 24 timer, trypsinisert og anvendt som indikert.
HT-29
Cld1 og HT-29
Cld3 Cell Anlegg
HT -29
Cld1, HT-29
Cld3 eller tom-vektor (HT-29
pBABE) celler ble generert av transducing HT-29 villtype celler med pBABE-Cld1, pBABE-Cld3 eller tomme vektorer og velge vellykket transduced celler med 7,5 mikrogram /ml puromycin (Cat ingen P8833,.. Sigma-Aldrich) i minst 5 dager. Klonene ble isolert og overekspresjon av Claudins 1 og 3 ble bekreftet av immunoblotting.
claudin-3 lyddemping
HT-29 celler ble transfektert med enten en ikke-måls kontroll siRNA (siRNA negativ kontroll # 1;. Cat ingen 4.390.844,. Ambion, TX, USA), scramble som en kontroll for ikke-sekvensspesifikke effekter, eller en claudin-3-spesifikke siRNA sekvens (Silencer ferdige siRNA CLDN3, Cat ingen SI03101623..; Qiagen, MD, USA). Cellene (10
6) ble resuspendert i 100 ul 1SM buffer [30], vennlig levert av Dr. Martin Bonamino (Inca, Brasil), som inneholder enten kryptert eller CLDN3 spesifikke duplex. Cellene ble overført i en 0,2 cm skål (Cat ingen MIR 50121,.. Mirus Biotech, Madison, WI, USA) og electroporated med W-17 programmet for Lonza Nucleofector II electroporation system for HT-29 celler (Lonza Group Ltd , Basel, Sveits). Cellene ble deretter forsiktig resuspendert i DMEM supplementert med 10% FBS til en sluttkonsentrasjon på 25 siRNA eller 45 nM. Dempingen av CLDN3 uttrykk ble verifisert ved immunoblotting cellelysater og sondering dem med et antistoff mot claudin-3.
Cell Utvinning og Immunoblotting
Caco-2 (3 x 10
5) og HT-29 (2 x 10
5) celler ble sådd i 6-brønns plater og inkubert inntil konfluens. Celle molayers ble så skrapet og homogenisert i lyseringsbuffer (1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,2% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH 7,3) som inneholdt 20 mM NaF, 1 mM ortovanadat og en protease inhibitor cocktail (1:100 fortynning) for å oppnå totale cellelysater. Den homogeniserte Lysatene ble sentrifugert ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatantene ble samlet og lagret ved -20 ° C for senere analyse. Like mengder av protein (30 ug /felt) per prøve ble separert ved hjelp av SDS-PAGE-elektroforese på 13% geler og overført til nitrocellulose-ark. Membranene ble blokkert og inkubert med primære antistoffer mot claudin-1 (1:500), claudin-3 (2 ug /ml), eller α-tubulin (1:1000). Etter vasking ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus-antistoffer. Proteinene ble visualisert ved hjelp av en forbedret chemiluminescence kit (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). Båndene ble kvantifisert i henhold til deres optisk tetthet ved hjelp LabWorks 4,6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
immunfluorescens
Caco-2 (2 × 10
5) og HT -29 (10
5) celler ble sådd på dekkglass i 24-brønners plater og inkubert inntil konfluens. Av cellemonolagene ble deretter vasket med PBS og fiksert med metanol i 10 minutter ved -20 ° C. Deretter ble cellene blokkert med 0,2% BSA i PBS i 1 time og permeabilisert med 0,1% Triton X-100. Cellene ble inkubert over natten med anti-claudin-1, anti-claudin-3 (1:40), anti-E-cadherin (1:300) antistoffer, etterfulgt av 1 h inkubering med de passende Alexa 488-konjugerte sekundære antistoffer ( 1:500). Etter inkuberingene ble cellene montert ved anvendelse av n-propyl-gallat for å tillate visualisering med enten en Axio Observe.Z1 mikroskop som var utstyrt med en AxioCam HRc og AxioVision utløsning 4,8 digital bildebehandling (Carl Zeiss Inc., Jena, Tyskland) eller et konfokal laser scanning mikroskop
FV10i-O
, der bildene ble analysert ved hjelp av FV10-ASW programvare (Olympus, Tokyo, Japan).
Wound Healing analysen
HT-29-celler (2 x 10
5) ble sådd i 6-brønns plater og inkubert inntil konfluens. For å utføre sårhelende analyser, ble cellemono manuelt såret ved å skrape med pipettespisser. Etter forskjellige behandlinger, ble cellene tillatt å migrere inn i de utarmede områder og fotografert umiddelbart etter at såret (0 h) og ved 6 timer eller 24 timer etter såret. Avstanden mellom de to kanter av et ribbet område ble kvantifisert i triplikat og gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre. Migrasjon er representert som en prosentandel av cellemigrering og plottet i en graf.
celleproliferasjon Assays
De relative levedyktige celler ble bestemt ved anvendelse av krystallfiolett eller trypanblått-farvestoffer. Den krystallfiolett-metoden ble utført som tidligere beskrevet [31]. I korthet, den HT-29-celler (10
4) ble utsådd i 96-brønners plater og inkubert i kulturmedium med eller uten EGF i 24 og 48 timer før fiksering ethanol i 10 min. En krystallfiolett oppløsning (0,05% krystallfiolett og 20% metanol) ble tilsatt til cellene i 10 min. Cellene ble vasket og oppløseliggjort med metanol. Absorbansene på 595 nm ble målt med en Spectra Max 190 spektrofotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). For trypanblått-metoden, ble transdusert HT-29-celler (2 x 10
5) utsådd i 6-brønners plater og inkubert i dyrkningsmediet i 6 timer. Etter inkuberingene ble cellene trypsinbehandlet (0,05% trypsin /0,02% EDTA i PBS-oppløsning) og telles på en Axio Observe.Z1 mikroskop (Zeiss) med et Neubauer kammer hemacytometer og Trypan blått fargestoff (0,4% trypanblått i PBS-oppløsning) .
Anchorage avhengig og-uavhengig Colony Forming
for forankringsavhengige koloni formasjon analyser, ble HT-29 celler sådd ut ved en lav tetthet (2,5 × 10
2) for 4 h i 12-brønners plater og behandlet med EGF i 5 dager eller ubehandlet. Etter 5 dager ble cellene fiksert med etanol i 10 minutter og farget med krystallfiolett-oppløsning (0,05% krystallfiolett og 20% i metanol). Cellene ble vasket to ganger med vann og oppløst med metanol. Koloniene ble enten regnet med Axio Observer.Z1 mikroskop (Zeiss) eller absorbansene ble målt ved 595 nm med en Spectra Max190 spektrofotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
For forankringsuavhengig koloni dannelsesanalyser, 12-brønners plater ble belagt med vekstmedium supplert med 10% FBS inneholdende 0,6% agarose for å unngå celle adhesjon til substratet. HT-29-celler (5 x 10
2) ble deretter resuspendert i kulturmedium som inneholdt 10% FBS, pluss 0,3% agarose, sådd på substratet som er beskrevet ovenfor og underkastet forskjellige behandlinger i 11 dager (som angitt). Ved endepunktet, ble koloniene telles med Axio Observer.Z1 mikroskop (Zeiss).
Måling av transepitelial elektrisk motstand (TER)
TJ funksjonalitet ble også vurdert ved å måle TER til evaluere den paracellulære fluksen til ioner, som tidligere beskrevet av Contreras og medarbeidere [32] med små modifikasjoner. I korthet, transduserte HT-29-celler (10
4) ble sådd ut ved konfluens på Transwell polyester membrancellekultur setter inn med en 0,4 pm porestørrelse og 0,33 cm
2 overflateareal (Cat nr CLS3470;.. Sigma-Aldrich ). TER-verdier ble bestemt med en Millicel-ERS-system (Millipore Co., Billirica, MA, USA). De plottede på grafen verdier ble normalisert til området av innsatsen og blindverdien (bad-løsning inkubert med innsatsen uten celler) ble subtrahert. TER ble dermed målt i ohm × cm
2 (Ω · cm
2).
makromolekyl Permeabilitet analysen
For ytterligere å teste TJ funksjonalitet, makromolekyl permeabilitet ble vurdert ved hjelp av et antistoff permeabilitet assay som tidligere beskrevet [33]. Transduserte HT-29-celler (10
5) ble sådd ut på dekkglass i 24-brønners plater og inkubert inntil konfluens. Av cellemonolagene ble deretter fiksert i 2% paraformaldehyd og inkubert med anti-uvomorulin /E-cadherin antistoff i 2 timer under nonpermeabilization betingelser, etterfulgt av 1 time inkubasjon med den respektive sekundære antistoff ved 37 ° C. Den uvomorulin /E-cadherin farging ble visualisert med en Axio Observer.Z1 mikroskop (Zeiss).
Statistical Analysis
En statistisk analyse ble utført med en enveis ANOVA, etterfulgt av Dunnetts post -UNDERSØKELSER eller t-test ved bruk av GraphPad Prism 4,02 programvare (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Grafene representerer gjennomsnitt ± standardfeil (SEM) av tre uavhengige eksperimenter. En forskjell på p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
EGF Øker protein nivåer av claudin-3 i HT-29 celler, men ikke i Caco-2 celler
i utgangspunktet undersøkte vi endringer i uttrykket nivåer av claudin-en og claudin-3 etter EGF behandling i to kolorektal adenokarsinom cellelinjer, Caco-2 og HT-29, som varierer i differensiering status og metastatisk potensial. Vi observerte at EGF-behandling ikke signifikant påvirker proteinnivåer Claudins 1 og 3 i Caco-2 og HT-29 celler på et tidlig tidspunkt (6 h) (fig. 1A). Etter langvarig EGF-behandlingstider (24 og 48 h), ble proteinnivåer Claudins 1 og 3 ikke er endret i vesentlig grad i Caco-2 celler. Imidlertid, HT-29-celler viste signifikant økte nivåer av claudin-3, mens nivåene av claudin-1 var uendret i dette samme tidspunkt av behandling (Fig. 1B). Videre immunofluorescens-analyse indikerte at EGF behandling i 48 timer endret ikke fordelingsmønstre Claudins 1 og 3 i Caco-2-celler (Fig. 2A). Ikke desto mindre ble det observert en diskontinuerlig fargemønster og den punktlig akkumulering av disse proteiner i enkelte celle-celle-kontaktområder av HT-29-celler (Fig. 2B). Fordi EGF ikke forandre proteinnivåer Claudins 1 og 3 i Caco-2 celler, undersøkte vi hvorvidt EGF kan aktivere effektor-baner i denne cellelinje. Vi har bekreftet at EGF behandling øket fosforylering nivåene av ERK1 /2 (Fig. S1), en kjent signale effektor utløst av EGF. Disse resultater indikerer at EGF behandling differensielt regulerer Claudins 1 og 3, avhengig av celle sammenheng. Basert på disse resultatene, valgte vi HT-29-celler for etterfølgende funksjonelle analyser på grunn av endringer observert i ekspresjonen og subcellulære fordeling av claudinet proteinene etter EGF behandling.
Dyrkede Caco-2 og HT-29 celler ble behandlet med EGF (20 ng /ml) i 6 timer (A), 24 timer og 48 timer (B). Etter EGF behandling, ble de totale cellelysatene høstet og analysert ved immunblotting for ekspresjon av Claudins 1 og 3. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Tallene representerer forholdet mellom den optiske densitet av EGF-behandlede med ubehandlede celler normalisert ved α-tubulin.
claudin
; Cld. α
-tubulin
; α-tub.
Cell monolagene ble dyrket på dekkglass og behandlet for immunfluorescens analyse av claudin-en og claudin-tre fordeling etter EGF behandling (48 h). De fargede celler ble sett på med konfokal
FV10i-O eller
Axio Observe.Z1 mikroskoper. (A) Caco-2 celler
; bar: 5
mikrometer. (B) HT-29 celler; bar: 10 mikrometer.
Pilspisser
; punktlig opphopning av Claudins.
Ctr
; kontroll.
EGF Behandling Øker Migrasjon og forankringsavhengige og Anchorage-Uavhengig Colony Forming av HT-29 Cells
Vi har vist at økt celle migrasjon er knyttet til mekanismer for svulst progresjon i kreftceller [10], [31], og som EGF behandlingen økte migrasjonen av Caco-2-celler [34]. For å avgjøre om EGF endret migrering av HT-29 celler, utførte vi sårhelende analyser etter EGF behandling. Vi har observert at etter 24 timer av EGF behandling ble cellepotensialet vandrende økt sammenlignet med den for ubehandlede celler (fig. 3A og 3B). For ytterligere å undersøke hvorvidt den til lukking av sår var faktisk på grunn av overføringsstatusen og ikke celleproliferasjon, bekreftet at det relative antall levedyktige celler. Figur 3C viser at celleproliferasjon ikke ble endret i EGF-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler på samme tid-punktet som ble observert i den sårhelende analysen. En økning i celleformering ble observert bare 48 timer etter behandling EGF.
(A, B) HT-29 celler ble dyrket i 6-brønns plater inntil sammenflytende. Deretter ble cellemonolagene såret og behandlet med EGF, og cellevandring i disse regionene ble overvåket i 24 timer. (C) HT-29 celler ble sådd i 96-brønns plater og behandlet med EGF På de angitte tidspunkter, og proliferasjonen ble kvantifisert ved hjelp av krystallfiolett-teknikk. Den søylediagram som viser forholdet mellom absorbans av EGF-behandlede med ubehandlede celler (kontroll). Bar: 100 mikrometer. Feilstolper indikerer middelverdier ± SEM (n = 3); ** P 0,01, *** p 0,001 som bestemt ved t-test
Det er kjent at celletransformasjon er en viktig parameter for å vurdere den maligne potensial, som også kan bli vurdert av. evnen til cellene til å danne forankringsavhengige og forankringsuavhengige kolonier [35], [36]. I denne sammenheng, vurderte vi celle-trans potensialet av EGF i HT-29 celler. Som observert i figur 4A, EGF-behandlede celler viste et høyere antall forankringsavhengige kolonier sammenlignet med ubehandlede celler. Videre EGF behandling økt antall forankringsuavhengig kolonier og koloni størrelser sammenlignet med (Fig. 4B) kontrollceller. Sammen viser disse data at EGF forbedrer hendelser relatert til den maligne potensial av udifferensierte kolorektal kreftceller.
(A) Representative fotografier av forankringsavhengige kolonier som ble farget med krystallfiolett etter EGF behandling. Baren Grafene viser forholdet mellom gangers økning i foci dannelsen av EGF-behandlet for ubehandlede celler (kontroll). (B) Representative bilder av forankringsuavhengig kolonier som viser forskjellene i størrelse mellom EGF-behandlede og ubehandlede celler. Stolpediagrammene viser forholdet mellom gangers økning i kolonidannelse av EGF-behandlede med ubehandlede celler (kontroll). Bar: 10 mikrometer. Feilstolper indikerer middelverdier ± SEM (n = 3); * P 0,05, ** p 0,01 som bestemmes av t test
ERK1 /2 og PI3K-Akt Signa Mediate EGF skapt økning Cell Migrasjon og kolonidannelse av HT-29 celler.
EGF er kjent for å aktivere signalveier, for eksempel ERK1 /2 og PI3K-Akt, for å regulere celleproliferering, differensiering og overlevelse i forskjellige tumorcellemodeller. Derfor analyserte vi om disse banene kan også modulere de underliggende EGF-indusert hendelser som vi hadde observert her, blant annet økningen i claudin-tre uttrykk. Som vist i figur 5A, EGF behandling øket fosforylering nivåene av ERK1 /2 og Akt, som indikerer aktivering av disse proteinene. Deretter vi farmakologisk hemmet MEK1 /2-ERK1 /2 og PI3K-Akt trasé med PD98059 og LY294002, henholdsvis, for å verifisere hvorvidt disse banene kan modulere den EGF-induserte økning i claudin-3-ekspresjonsnivåer i HT-29-celler. Vi har observert at behandling med disse inhibitorer alene eller i kombinasjon forhindret den EGF-induserte økning i claudin-3-ekspresjonsnivåer (Fig. 5B). Videre observerte vi at inhibering av ERK1 /2 og PI3K-Akt signalveier forhindret EGF-induserte økning i cellemigrering (fig. 5C). I figurene 5D og 5E, vi videre fastslått at inhibering av begge baner forhindres EGF-induserte økninger i antallet av forankringsavhengige og forankringsuavhengige kolonier. Interessant, forbehandling med PI3K-inhibitoren alene og i kombinasjon med ERK1 /2-inhibitor ble redusert forankringsavhengige kolonidannelse. Sammen utgjør disse dataene sterkt støtte ideen om at de ERK1 /2 og PI3K-Akt trasé er også involvert i økte claudin-3 uttrykk nivåer, samtidig til økt ondartet potensialet som er indusert av EGF i HT-29 celler.
(A) HT-29-celler ble dyrket og behandlet med EGF i 5, 15, 30 og 60 min, hvoretter de totale cellelysatene ble høstet og analysert ved immunblotting for p-ERK1 /2, ERK1 /2, p- Akt, og Akt. (B) Celler ble dyrket og forbehandlet i 1 time med de angitte inhibitorer før inkubering med EGF i 48 timer. Totale cellelysater ble høstet og analysert ved immunblotting for claudin-3. a-Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Tallene representerer forholdet mellom den optiske densitet for behandlede med ubehandlede celler normalisert ved total protein eller α-tubulin. Representative bilder av sårheling (C), forankringsavhengig kolonidannelse (D) og forankrings-uavhengig kolonidannelse (E) analyser. Cellene ble forbehandlet med de inhibitorer som angitt, og assayene ble utført som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. For forankringsavhengige analyse, viser søylediagrammet forholdet mellom gangers økning i foci dannelse av behandlede med ubehandlede celler (kontroll). For den forankrings-uavhengig assay stolpediagrammene viser forholdet mellom gangers økning i kolonidannelse av behandlede med ubehandlede celler (kontroll). Bar: 200 mikrometer. Feilstolper indikerer middelverdier ± SEM (n = 3); ** P. 0,01 som bestemmes av en ANOVA
Tvungen Overuttrykte claudin-en og claudin-3 øker TER, men claudin-3 Overuttrykte Forenkler paracellulære Flux til makromolekyler
Basert på resultatene som er beskrevet ovenfor, vi postulerte at differensial uttrykk nivåer av claudin-en og claudin-3 spiller viktige roller i kolorektal kreft progresjon. For ytterligere å teste denne hypotese, tvinges vi ekspresjon av claudin-1 og claudin-3-cDNA i HT-29 celler, og de resulterende cellene ble navngitt HT-29
Cld-1 og HT-29
Cld-3- hhv. Immunoblot-analyse bekreftet robust claudin-1 (HT-29
Cld-1) og claudin-3 (HT-29
Cld-3) overekspresjon sammenlignet med celler som ble transdusert med den tomme vektoren (HT-29
pBABE) (fig. 6A). Videre celler som overuttrykt disse proteinene som vises økt cytoplasma farging; imidlertid, ble det merking holdt ved celle-celle-kontakter (fig. 6B).
(A) Cellene ble dyrket, og de totale cellelysatene ble høstet og analysert ved immunblotting for ekspresjon av claudin-1 og claudin- 3. Tallene representerer forholdet mellom den optiske densitet for claudin-transdusert til tom vektor-transduserte celler normalisert ved α-tubulin. (B) celler ble dyrket på dekkglass og bearbeidet under permeabilizing betingelser for immunofluorescensanalyse av claudin-1 og claudin-3-fordeling; bar: 5 mikrometer. (C) Cellene ble dyrket på Transwell innsatser og TER ble målt ved bruk av Millicel-ERS system. Baren kurver viser TER verdiene normalisert for området av innsatsen med blank verdi trekkes fra. (D) Cellene ble dyrket på dekkglass og behandlet for immunofluorescens under ikke-permeabilizing betingelser for å evaluere makromolekylær permeabilitet ved bruk av anti-uvomorulin /E-cadherin antistoff; bar: 10 mikrometer. (E) Celler ble dyrket på dekkglass og bearbeidet under permeabilizing betingelser for immunofluorescensanalyse av E-cadherin fordeling. De fargede celler ble sett på med
FV10i-O
konfokalmikroskop. Feilstolper indikerer middelverdier ± SEM (n = 3); α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting.
